王 晶 謝麗菲 孟 潔 劉 健 許海燕

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005)

陰離子化高分子包覆非病毒載體提高有血清環(huán)境下RNA干擾效率的研究

王 晶 謝麗菲 孟 潔 劉 健#*許海燕#*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005)

大多數(shù)陽離子化高分子載體在血清環(huán)境中會(huì)大量吸附血清蛋白而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下，因而難以應(yīng)用于臨床。設(shè)計(jì)合成羧基化葡聚糖(Dex-COOH)和羧基化葡聚糖修飾富勒烯(C60-Dex-COOH)兩種陰離子化高分子，并將其包覆在精胺化普魯蘭(Ps)與siRNA形成的復(fù)合物(PS/siRNA)外層，以減少復(fù)合物對(duì)血清蛋白的吸附。采用DLS/ELS檢測(cè)陰離子包覆前后復(fù)合物的顆粒粒徑及Zeta電位；用QCM-D驗(yàn)證陰離子包覆層的形成，并評(píng)價(jià)包覆層對(duì)牛血清白蛋白(BSA)吸附的影響；同時(shí)應(yīng)用cck-8試劑、流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)包覆前后及不同包覆比例下復(fù)合物的細(xì)胞毒性、進(jìn)入細(xì)胞的情況及對(duì)Hela-EGFP細(xì)胞的干擾效率。結(jié)果表明，Dex-COOH與C60-Dex-COOH能夠在PS/siRNA外部形成穩(wěn)定的負(fù)電性包覆層，有效阻止BSA的吸附，并在無血清的條件下顯著降低復(fù)合物的細(xì)胞毒性；在有血清的環(huán)境中，表面包覆了陰離子化高分子的復(fù)合物可以不受血清蛋白的影響而被細(xì)胞大量攝取。對(duì)包覆了C60-Dex-COOH的PS/siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染組施加光照，可促使復(fù)合物從溶酶體中逃逸，將血清條件下PS/siRNA的干擾效率提高20%。該策略可有效提高陽離子化高分子載體介導(dǎo)的RNA干擾效率。

陽離子化高分子；siRNA載體；陰離子包覆層；蛋白吸附；RNA干擾

引言

基因治療(gene therapy)是一種全新的治療手段，近年來受到廣泛關(guān)注[1-3]。但是，核酸分子本身難以進(jìn)入細(xì)胞，而且在體內(nèi)環(huán)境中易被酶破壞[4]。因此，利用遞送載體將核酸分子導(dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)部并使其發(fā)揮作用，是實(shí)現(xiàn)基因治療的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在此背景下，各種類型的核酸載體被不斷研發(fā)，其中非病毒載體由于具有免疫原性低、無載體容量限制、材料來源廣泛、化學(xué)結(jié)構(gòu)可控制且易于大量制備等諸多優(yōu)點(diǎn)，始終是核酸載體領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[5]。

目前的非病毒載體大多屬于陽離子聚合物或陽離子脂質(zhì)體，其主要特點(diǎn)是載體分子中含有大量在生理?xiàng)l件下帶正電的基團(tuán)，可以與帶負(fù)電的核酸分子形成帶正電的復(fù)合物，從而通過靜電作用接近并進(jìn)入細(xì)胞，并利用質(zhì)子海綿效應(yīng)促進(jìn)溶酶體破裂和核酸分子的釋放[6-7]。但是，陽離子載體在使用上仍存在一些缺陷[8-10]：一是過高的陽離子基團(tuán)會(huì)造成細(xì)胞膜損傷，并導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。二是在有血清培養(yǎng)的條件下，陽離子載體在短時(shí)間內(nèi)會(huì)大量吸附血清蛋白，形成蛋白冠，導(dǎo)致復(fù)合物難以接近并進(jìn)入細(xì)胞；即使進(jìn)入了細(xì)胞，表面吸附的蛋白也會(huì)削弱其引起的質(zhì)子海綿效應(yīng)，降低溶酶體逃逸效率。三是在體內(nèi)環(huán)境下，由于靜電作用的非特異性，陽離子載體難以精確到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞。盡管有研究表明，通過表面修飾靶向性分子可以提高載體的特異性，但蛋白冠的形成仍會(huì)妨礙靶向分子的作用[11-12]。此外，吸附了血漿蛋白的復(fù)合物容易發(fā)生聚集，并在體內(nèi)循環(huán)中被快速清除[13]。以上這些因素，極大限制了陽離子載體的應(yīng)用。

在以往工作中，將天然大分子普魯蘭多糖經(jīng)過側(cè)鏈精胺修飾得到了普魯蘭精胺(pullulan-spermine，PS)，發(fā)現(xiàn)其具有良好的轉(zhuǎn)染效率，是一種有前途的陽離子化非病毒載體[14]。本研究的目的是通過靜電自組裝作用，在PS與siRNA所形成的復(fù)合物(PS/siRNA)表面構(gòu)筑一層負(fù)電性外殼，一方面降低載體的細(xì)胞毒性，另一方面阻止蛋白的吸附?？紤]到被負(fù)電層包裹后復(fù)合物難以通過質(zhì)子海綿效應(yīng)實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸，進(jìn)一步在陰離子高分子鏈中引入C60以賦予負(fù)電層光敏特性，利用光照觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，進(jìn)而破壞溶酶體膜，幫助復(fù)合物從溶酶體中釋放，提高RNA干擾效率。

1 方法

選用如下材料：普魯蘭多糖、精胺、氰基硼氫化鈉、葡聚糖、羰基二咪唑(CDI)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，購自Sigma-Aldrich公司(美國密蘇里州)；乙二胺、丁二酸酐、巰基丙酸、牛血清白蛋白(BSA)、鄰二氯苯、二甲基亞砜(DMSO)，購自阿拉丁生化科技股份有限公司(中國上海)；EGFP siRNA(5′-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCA-3′)[15]、NC siRNA(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′)[16]及熒光標(biāo)記的siRNA(siRNA-FAM)，購自吉瑪制藥技術(shù)有限公司(中國上海)；人宮頸癌細(xì)胞系Hela及綠色熒光蛋白標(biāo)記人宮頸癌細(xì)胞Hela-EGFP，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，并在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素與100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific，美國馬薩諸塞州)中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1 羧基化葡聚糖(Dex-COOH)的制備

稱取分子量10 000的葡聚糖100 mg，溶于30 mL無水DMSO中，分別加入丁二酸酐200 mg、DMAP 5 mg，在40℃下反應(yīng)24 h。產(chǎn)物置于截留分子量為3 500的透析袋中(Viskase Companies Inc)，以純凈水透析2 d后冷凍干燥3 d(LGJ-10C型，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠, 中國北京)。

1.2 羧基化葡聚糖修飾富勒烯(C60-Dex-COOH)的制備

1.2.1 末端氨基化葡聚糖的制備

稱取葡聚糖(分子量10 000)500 mg，以50 mL的PB緩沖液(pH=7.5)溶解，在室溫?cái)嚢柘戮従徏尤胍叶啡芤?5 mL，99%+)。加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.5后，向其中加入氰基硼氫化鈉20 mg，在磁力攪拌及60℃水浴加熱條件下反應(yīng)18 h。將反應(yīng)液置于截留分子量為3 500的透析袋中，以純凈水透析2 d后冷凍干燥3 d。

1.2.2 葡聚糖修飾C60(C60-Dex)的制備

稱取0.72 mg的C60，溶于5 mL鄰二氯苯中，使其充分溶解。稱取100 mg末端氨基化葡聚糖，溶于15 mL DMSO中。在37℃水浴中攪拌20 min，使其充分溶解。將兩相充分混合后，在15 W的LED燈光下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h。向產(chǎn)物中加入100 mL雙蒸水，充分混勻后分裝于50 mL的離心管中，以3 500 r/min離心30 min。取上層含有水溶性富勒烯的水溶液，透析(截留分子量12 000～14 000)除去DMSO。將溶液分裝于15 mL的離心超濾管(sartorius，截留分子量30 000)中，以4 500 r/min離心45 min。棄去下層濾液，并在上層加入雙蒸水后再次離心洗滌，重復(fù)該操作3次。收集上層濾液，并進(jìn)行冷凍干燥。

1.2.3 C60-Dex的羧基化

稱取100 mg的C60-Dex，溶于30 mL無水DMSO中。分別加入200 mg丁二酸酐及5 mg DMAP，40℃下攪拌反應(yīng)24 h。產(chǎn)物置于截留分子量為8 000的透析袋中，以純凈水透析2 d后冷凍干燥。

1.3 陰離子化高分子包覆PS/siRNA復(fù)合物的制備

利用靜電自組裝，按照以前報(bào)道的方法合成PS并純化[17]。將20 μL的siRNA(0.5 μg/μL)緩慢滴加于50 μL的PS水溶液(2 mg/mL)中，充分震蕩1 min后靜置15 min，使PS與siRNA形成穩(wěn)定的PS/siRNA復(fù)合物(N/P=20)。將70 μL含PS/siRNA復(fù)合物溶液分別滴加至70 μL不同濃度的Dex-COOH或C60-Dex-COOH水溶液中，充分震蕩1 min后靜置10 min，獲得不同包覆比例(陰離子化高分子與PS/siRNA復(fù)合物中PS的摩爾比)的陰離子化高分子包覆PS/siRNA復(fù)合物(PS/siRNA@Dex-COOH與PS/siRNA@ C60-Dex-COOH)。

1.4 復(fù)合物粒徑及表面電位的檢測(cè)

取不同配比的PS/siRNA@Dex-COOH或PS/siRNA@C60-Dex-COOH，配制成0.1 mg/mL的水溶液。按照儀器說明，取1 mL待測(cè)溶液置于樣品池中，在25℃條件下，檢測(cè)復(fù)合物的粒徑及Zeta電位(Zetasizer Nano ZS，馬爾文公司，美國)。

1.5 陰離子化高分子包覆層的形成及蛋白吸附的檢測(cè)

1.5.1 準(zhǔn)備表面為PS層的QCM芯片

將石英晶體微天平(QCM)金芯片表面用Piranha溶液(濃H2SO4∶30%H2O2=3∶1)處理后用超純水洗凈，迅速置于0.1%的巰基丙酸(MPA)溶液中浸泡2 h，并再次用純凈水洗凈，從而在金表面組裝上一層巰基丙酸的單層膜。將200 μL EDC(10 mg/mL)和200 μL NHS(10 mg/mL)滴加至金芯片表面，室溫活化30 min后用純凈水洗凈，并滴加1 mg/mL的PS水溶液200 μL于芯片表面，繼續(xù)在室溫下孵育2 h。最后，用水純凈水將芯片洗凈晾干備用。

1.5.2 BSA吸附量的測(cè)量

配制濃度為0.5 mg/mL的Dex-COOH水溶液，及0.01 mg/mL 的牛血清白蛋白(BSA)水溶液(PBS，pH=7.5)。將石英芯片置于QCM-D檢測(cè)器(Q-Sense E4，瑞典Biolin公司)中，37℃下緩慢通入雙蒸水。待基線穩(wěn)定后，實(shí)驗(yàn)組通入Dex-COOH溶液，使PS表面吸附一層Dex-COOH。待吸附量達(dá)到飽和時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組同時(shí)通入BSA水溶液至吸附達(dá)到飽和，記錄整個(gè)過程中QCM芯片振動(dòng)頻率的變化，從而計(jì)算芯片表面物質(zhì)吸附量的變動(dòng)情況。

1.6 流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)復(fù)合物的攝取

將Hela細(xì)胞按照60 000個(gè)/孔的密度播種于12孔板中，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜，使細(xì)胞貼壁。分別將PS/siRNA-FAM及不同包覆比例的PS/siRNA-FAM@Dex-COOH或PS/siRNA-FAM@C60-Dex-COOH加入孔內(nèi)，使每孔中siRNA的量均為1 μg。37℃孵育4 h后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗兩遍，用0.125%胰酶消化后離心收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(C6, BD公司，美國)檢測(cè)細(xì)胞中的FAM熒光強(qiáng)度。

1.7 PS/siRNA復(fù)合物處理后細(xì)胞活性的檢測(cè)

將Hela細(xì)胞按照6 000個(gè)/孔的密度播種于96孔板中，置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜，使細(xì)胞貼壁。分別將PS/siRNA及同包覆比例的PS/siRNA@Dex-COOH或PS/siRNA@C60-Dex -COOH 加入孔內(nèi)，使每孔中siRNA(NC)的量均為0.1 μg。37℃孵育4 h后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗兩遍。向每孔中加入含10% cck-8(Cell Counting Kit-8，同仁化學(xué)公司，日本)的新鮮培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)在37℃孵育2 h。用酶標(biāo)儀(Synergy H1， Bio Tek公司,美國)，檢測(cè)450 nm波長下的吸光度值。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)復(fù)合物的干擾效率

將Hela-EGFP細(xì)胞按照60 000個(gè)/孔密度播種于12孔板中，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜，使細(xì)胞貼壁。分別將PS/siRNA及不同包覆比例的PS/siRNA@Dex-COOH或PS/siRNA@C60-Dex-COOH加入孔內(nèi)，使每孔中siRNA(EGFP)的量均為1 μg。37℃孵育4 h后，PS/siRNA-EGFP@ C60-Dex-COOH組光照10 min (15 W LED燈)。棄掉培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗兩遍，加入1 mL新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用0.125%胰酶消化后離心收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(C6, 美國BD公司檢)測(cè)細(xì)胞的EGFP熒光強(qiáng)度。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陰離子包覆的PS/siRNA復(fù)合物的制備及表征

在研究中，合成了Dex-COOH(見圖1(a)的上圖)和C60-Dex-COOH(見圖1(b)的上圖)兩種陰離子化多糖，通過靜電自組裝作用，在正電性的PS/siRNA(NC)復(fù)合物外部形成陰離子化高分子的包覆層。由DLS/ELS檢測(cè)包覆前后復(fù)合物的顆粒尺寸及Zeta電位可知，包覆前PS/siRNA的尺寸為165 nm，Zeta電位為+43 mV，帶有大量多余正電荷。經(jīng)Dex-COOH和C60-Dex-COOH包覆后，Zeta電位均變?yōu)樨?fù)值(-20 ～ -40 mV)，表明兩種陰離子化高分子確實(shí)能夠形成穩(wěn)定的負(fù)電性包覆層，并能有效遮蔽PS/siRNA表面的正電荷。包裹后顆粒的尺寸較原始的PS/siRNA均略有減小，提示包覆后形成的負(fù)電層對(duì)帶正電的復(fù)合物會(huì)產(chǎn)生一定的壓緊效果。

圖1 陰離子化高分子的分子結(jié)構(gòu)(上)和不同包覆比下PS/siRNA復(fù)合物顆粒的尺寸與Zeta電位(下)。(a)Dex-COOH；(b)C60-Dex-COOH。 Fig.1 The chemical structure (above), hydrated diameter and Zeta potential (below) of PS/siRNA at different coating ratio.(a) Dex-COOH; (b) C60-Dex-COOH.

2.2 陰離子化高分子包覆對(duì)PS表面蛋白吸附的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PS表面是否能形成陰離子包覆層，并研究陰離子包覆層的形成是否能夠抑制PS/siRNA復(fù)合物對(duì)血清蛋白的吸附，首先在QCM金芯片表面共價(jià)包被了一層PS分子，以模擬PS/siRNA復(fù)合物的表面；陰離子化高分子及蛋白分子在PS表面的吸附情況可以通過QCM芯片的振動(dòng)頻率F值(吸附量)及耗散因子D值(吸附層的黏彈性屬性)的變化進(jìn)行表征[18-19]。

當(dāng)BSA流過包被了PS的芯片表面時(shí)，F(xiàn)值迅速下降，說明帶正電的PS能夠在短時(shí)間內(nèi)迅速吸附大量BSA；而此時(shí)D值并無明顯變化，說明吸附的蛋白層結(jié)構(gòu)緊密，呈剛性(見圖2(a))。而向包被PS的芯片表面通入陰離子化高分子(Dex-COOH)溶液時(shí)，F(xiàn)值緩慢下降，D值略微上升后達(dá)到平衡，表明Dex-COOH可以在PS表面形成一層穩(wěn)定的彈性吸附層；隨后在更換BSA溶液流過時(shí)，F(xiàn)值僅有輕微的下降，并在接下來的400余秒(1 200～1 620 s)內(nèi)基本保持不變，表明陰離子層的形成能夠有效減少BSA的吸附。在持續(xù)通入BSA的條件下，1 620 s之后F值會(huì)再次出現(xiàn)緩慢下降，而D值略有上升，推測(cè)是由于Dex-COOH被逐漸洗脫而導(dǎo)致了蛋白的再次吸附，但此時(shí)形成的白蛋白分子的吸附層與對(duì)照組相比其結(jié)構(gòu)比較松散，因此呈現(xiàn)一定的黏彈性(見圖2(b))。

圖2 向PS包被的QCM芯片表面通入Dex-COOH及BSA時(shí)芯片振動(dòng)頻率F及耗散因子D的變化。(a)單純通入BSA(0.01 mg/mL)；(b)先后通入Dex-COOH(0.5 mg/mL)及 BSA(0.01 mg/mL)Fig.2 The changes of F and D curves after adsorption of different materials on the QCM chip coated with PS. (a) The adsorption of BSA (0.01 mg/mL); (b)The adsorption of Dex-COOH(0.5 mg/mL)and BSA (0.01 mg/mL)

2.3 陰離子化高分子的包覆量對(duì)細(xì)胞內(nèi)吞的影響

圖3 Hela細(xì)胞與不同包覆狀態(tài)的復(fù)合物顆粒孵育后熒光陽性細(xì)胞的比率(上)及細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(下)(*P<0.05,**P<0.01:與有血清條件下PS/siRNA組平均熒光強(qiáng)度相比具有顯著性差異)。(a)不同包覆比例的PS/siRNA-FAM@Dex-COOH；(b)不同包覆比例的PS/siRNA-FAM@C60-Dex-COOHFig.3 The percentage of positive cells (above) and mean fluorescence intensity (below) of Hela cells cultured in the presence of different complexes with different coating ratio (*P<0.05,**P<0.01: significance against mean fluorescence intensity of PS/siRNA with serum). (a) PS/siRNA-FAM@Dex-COOH; (b) PS/siRNA@C60-Dex-COOH

將Hela細(xì)胞與熒光標(biāo)記的PS/siRNA-FAM共孵育后，通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，以評(píng)價(jià)血清和包覆比例(陰離子化高分子與PS/siRNA復(fù)合物中PS的摩爾比)對(duì)PS/siRNA內(nèi)吞量的影響(見圖3)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，無論是否存在血清，不同包覆比例的PS/siRNA復(fù)合物均能進(jìn)入細(xì)胞，且陽性率均能達(dá)到80%以上。平均熒光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)表明，PS/siRNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的量受血清及包被條件的影響很大。在無包覆時(shí)，無血清條件下平均熒光強(qiáng)度是有血清條件下的4倍，推測(cè)可能是復(fù)合物表面吸附大量蛋白后產(chǎn)生的電位反轉(zhuǎn)影響了細(xì)胞的內(nèi)吞；而預(yù)先經(jīng)陰離子化高分子包覆的PS/siRNA進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量則不受血清條件的影響，但與包覆分子種類及包覆比密切相關(guān)。對(duì)于PS/siRNA@Dex-COOH而言，當(dāng)包覆比為3∶1時(shí)，細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度達(dá)到最高，較未包覆時(shí)明顯升高，甚至略高于無血清、無包覆條件下細(xì)胞的熒光強(qiáng)度；但當(dāng)包覆比例繼續(xù)增大時(shí)，平均熒光強(qiáng)度反而逐漸減少。當(dāng)使用C60-Dex-COOH作為包覆分子時(shí)，不同包覆比下細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度差別較小，均較未包覆時(shí)有明顯提高，并且在包覆比為3.5時(shí)達(dá)到最大值，但都低于無血清、無包覆條件下細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

2.4 陰離子化高分子的包覆量對(duì)PS/siRNA復(fù)合物細(xì)胞毒性的影響

圖4為包覆前后PS/siRNA復(fù)合物對(duì)細(xì)胞毒性的影響。由圖可知，PS/NC siRNA在無血清條件下表現(xiàn)出了較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，經(jīng)過4 h的轉(zhuǎn)染后，Hela細(xì)胞的活性僅有對(duì)照組的20%；而在有血清培養(yǎng)條件下，細(xì)胞活性接近對(duì)照組的80%，表明血清中蛋白的吸附雖然影響了PS的內(nèi)吞，但能夠大幅降低PS的細(xì)胞毒性。在表面包覆Dex-COOH與C60-Dex-COOH兩種陰離子化高分子后，無血清條件下轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的活性有明顯升高，并且在各種包覆比下均能夠達(dá)到60%以上，表明陰離子化高分子的包覆能夠有效遮蔽PS/NC siRNA表面的正電荷，降低無血清環(huán)境下復(fù)合物的細(xì)胞毒性；而在有血清環(huán)境下，高分子的包覆對(duì)細(xì)胞活性沒有顯著影響。

圖4 經(jīng)PS/siRNA及不同包覆狀態(tài)復(fù)合物處理后Hela細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活性(siRNA(NC)的量為0.1 μg/孔，正常培養(yǎng)組細(xì)胞的活性設(shè)為1(con.組中的白色柱;*P<0.05，**P<0.01)：與無血清條件下PS/siRNA組細(xì)胞活性相比，具有顯著性差異)。(a)不同包覆比例的PS/siRNA@Dex-COOH；(b)不同包覆比例的PS/siRNA@C60-Dex-COOH。Fig.4 The cell viability ratio of Hela cells cultured in the presence of different complexes with different coating ratio (The amount of siRNA (NC) added to each well was 0.1 μg; The cell viability of untreated group (with serum) was set to 1 and white column is the control group;*P<0.05,**P<0.01: significance against cell viability of PS/siRNA without serum). (a) PS/siRNA-FAM@Dex-COOH; (b) PS/siRNA@C60-Dex-COOH

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)復(fù)合物干擾效率

將PS/siRNA及不同包覆比例的PS/siRNA @Dex-COOH、PS/siRNA@C60-Dex-COOH與Hela-EGFP細(xì)胞共孵育4 h后，對(duì)PS/siRNA@ C60-Dex-COOH組給予10 min光照，繼續(xù)孵育48 h后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，評(píng)價(jià)RNA干擾效率(見圖5)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，無血清條件下，未包覆的PS/siRNA-EGFP干擾效率最高，能夠達(dá)到60%以上。陰離子化高分子包覆后的PS/siRNA-EGFP所介導(dǎo)的干擾效率明顯降低，特別是Dex-COOH包覆組的干擾效率均在20%以下；而C60-Dex-COOH包覆對(duì)干擾效率的影響相對(duì)較小，經(jīng)過光照射后可以達(dá)到40%左右(包覆比高于3.5時(shí))。但是，在有血清的環(huán)境下，未包覆的PS/siRNA-EGFP介導(dǎo)的干擾效率則顯著降低，只能達(dá)到約15%；用Dex-COOH包覆后，干擾效率沒有明顯提高；但是對(duì)C60-Dex-COOH 包覆的PS/siRNA-EGFP復(fù)合物進(jìn)行可見光照射后，包覆比例高于3.5的復(fù)合物所介導(dǎo)的干擾效率顯著提高，達(dá)到40%，相比有血清條件下的PS/siRNA-EGFP，其干擾效率提高了約20%。

圖5 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同包覆狀態(tài)的PS/siRNA復(fù)合物對(duì)Hela-EGFP細(xì)胞的干擾效率。 (a) 不同包覆比例的PS/siRNA@Dex-COOH;(b)不同包覆比例的PS/siRNA@C60-Dex-COOH, siRNA(EGFP)的量為1 μg/孔 (**P<0.01：與有血清條件下PS/siRNA組干擾效率相比具有顯著性差異)Fig.5 The RNA interference efficiency of Hela-EGFP cells culture in the presence of PS/siRNA@Dex-COOH (a) or PS/siRNA@C60-Dex-COOH (b) With different coating ratio, the amount of siRNA (EGFP) added to each well was 1 μg (**P<0.01: significance against RNA interference efficiency of PS/siRNA with serum)

3 討論

基于siRNA、mRNA等的RNA干擾治療可以特異性地沉默細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)，與質(zhì)粒等核酸藥物不同，RNA藥物只要進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)即可發(fā)揮作用，而且不會(huì)改變目標(biāo)細(xì)胞的基因序列，具有特異性好的優(yōu)勢(shì)且安全性較高，因此成為基因治療中的一個(gè)重要技術(shù)。但是，缺乏合適的載體是妨礙RNA干擾治療進(jìn)入臨床的一個(gè)主要瓶頸。陽離子非病毒載體在無血清條件下易于獲得較高的干擾效率，但同時(shí)也伴隨著較高的細(xì)胞毒性；在有血清條件下，血清蛋白的吸附會(huì)顯著降低陽離子載體的細(xì)胞毒性，但同時(shí)也會(huì)妨礙細(xì)胞對(duì)載體的內(nèi)吞，并使其難以發(fā)揮質(zhì)子海綿效應(yīng)，從而導(dǎo)致干擾效率的低下。因此，這一悖論是目前陽離子載體所不能回避的一個(gè)共同問題。降低無血清條件下的細(xì)胞毒性，或提高有血清條件下的轉(zhuǎn)染效率，也正是目前非病毒載體研究中的一個(gè)主要目標(biāo)。本研究設(shè)計(jì)了siRNA載體，其特點(diǎn)是利用光敏性陰離子化高分子的靜電自組裝，在siRNA載體外層形成帶負(fù)電的高分子層，在無血清條件下抑制細(xì)胞毒性，在有血清條件下阻礙血清蛋白的吸附，并利用光敏劑的光化學(xué)內(nèi)化(photochemical internalization，PCI)效果提高核酸藥物的溶酶體逃逸效率，從而有望獲得良好的基因干擾效果。

在前期工作中，制備了一種精胺修飾的普魯蘭多糖(PS)，發(fā)現(xiàn)它對(duì)很多細(xì)胞都能發(fā)揮良好的轉(zhuǎn)染效率，但在含血清培養(yǎng)條件下其轉(zhuǎn)染效率會(huì)受到蛋白吸附的影響[20]?；诖?，本研究以PS作為模式陽離子非病毒載體，將合成的兩種陰離子化大分子Dex-COOH和C60-Dex-COOH通過靜電作用吸附于PS/siRNA表面，形成穩(wěn)定的包覆層，使復(fù)合物表面帶負(fù)電荷，在一定時(shí)間內(nèi)有效阻止BSA的吸附。

綜合分析比較細(xì)胞內(nèi)吞、毒性及轉(zhuǎn)染效率的結(jié)果可以看出：在無血清的條件下，陰離子化高分子包覆層對(duì)正電荷的遮蔽作用能夠有效降低復(fù)合物的細(xì)胞毒性；同時(shí)，通過優(yōu)化包覆比，仍然能夠獲得接近于非包覆組無血清條件下的內(nèi)吞量。雖然包覆后干擾效率有所降低，但當(dāng)包覆材料為C60-Dex-COOH時(shí)，由于C60的光敏性而使干擾效率達(dá)到40%以上，與未包覆組相比，僅僅降低了大約20%，但轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活性卻大幅提高了3倍左右，這一低毒特性對(duì)原代細(xì)胞、干細(xì)胞等敏感細(xì)胞的轉(zhuǎn)染會(huì)有很大的幫助。

在有血清的環(huán)境中，細(xì)胞毒性不再是陽離子siRNA載體的主要障礙，如何提高RNA干擾效率成為其首要目標(biāo)。相比未包覆組，陰離子化高分子包覆層促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)復(fù)合物的攝取，復(fù)合物的內(nèi)吞量可接近于無血清條件下的非包覆組。這可能是PS/siRNA被陰離子化多糖包覆后，細(xì)胞表面的糖蛋白受體也可能有助于其被細(xì)胞內(nèi)吞，而不僅僅依賴于靜電吸附作用。但是，更多進(jìn)入了細(xì)胞的PS/siRNA@ Dex-COOH并不能明顯提升PS/siRNA的干擾效率，推測(cè)是包覆陰離子化高分子層的PS/siRNA復(fù)合物被限制在溶酶體中，由于表面缺少陽離子而難以發(fā)揮質(zhì)子海綿效應(yīng)，不能及時(shí)從溶酶體中逃逸。當(dāng)采用光敏性陰離子化高分子C60-Dex-COOH作為包覆層時(shí)，光照刺激能夠有效提高PS/siRNA@C60-Dex-COOH的干擾效率，提示光照下C60誘發(fā)了活性氧的產(chǎn)生，能夠有效破壞溶酶體膜，促進(jìn)siRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而有效地發(fā)揮RNA干擾作用。

4 結(jié)論

Dex-COOH與C60-Dex-COOH兩種陰離子化高分子均能夠在PS/siRNA復(fù)合物外部形成穩(wěn)定的負(fù)電性包覆層，可有效阻止血清白蛋白的吸附；在無血清的條件下，顯著降低復(fù)合物的細(xì)胞毒性；在有血清的環(huán)境中，陰離子化高分子包覆可以在不增加細(xì)胞毒性的情況下，顯著提高復(fù)合物的內(nèi)吞量；而光敏性C60-Dex-COOH的包覆能夠在光照條件下幫助復(fù)合物從溶酶體中逃逸，從而有效提高有血清條件下PS/siRNA的干擾效率。

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Anionic Polymer Coating Enhance the RNAi Efficiency of Non-Viral Carriers in Serum Containing Environment

Wang Jing Xie Lifei Meng Jie Liu Jian#*Xu Haiyan#*

(InstituteofBasicMedicalSciencesChineseAcademyofMedicalSciences,SchoolofBasicMedicinePekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China)

The clinical application of cationic polymer carriers was limited because the adsorption of protein in serum environment led to low transfection efficiency. In this work, we synthesized carboxylic Dextran (Dex-COOH) and water-soluble carboxylic fullerene (C60-Dex-COOH) anionic polymers, coated on the pullulan-spermine and siRNA complex (PS/siRNA) to reduce the adsorption of serum protein. The particle size and Zeta potential were analyzed by DLS/ELS, respectively. The formation of anion coating and bovine serum albumin (BSA) adsorption of complexes were tested by QCM-D. Cellular uptake, cytotoxicity on the Hela cells and RNAi efficiency on the Hela-EGFP cells were examined by cck-8 reagent and flow cytometry. The results showed that Dex-COOH and C60-Dex-COOH could coat on PS/siRNA to form stable electronegative complexes, prevent the adsorption of serum effectively. Cytotoxicity of complexes was reduced in the absence of serum. On the other hand, in the serum environment, anionic polymer coated complexes could help complexes enter cells and PS/siRNA@C60-Dex-COOH with visible light irradiation would escape from the lysosome, increased the interference efficiency by 20% compared with PS/siRNA. In summary, this coating strategy provided an effective solution of increasing RNAi efficiency mediated by cationic polymers.

cationic polymer; siRNA carrier; anionic coating; protein adsorption; RNA interference

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 04.008

2016-03-21， 錄用日期:2016-05-10

國家自然科學(xué)基金(81271688)；國家重大科學(xué)研究計(jì)劃(2011CB933504)

R318

A

0258-8021(2016) 04-0445-08

# 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)高級(jí)會(huì)員(Senior member, Chinese Society of Biomedical Engineering)

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: liujian@ibms.pumc.edu.cn；xuhy@pumc.edu.cn