楊逸童，房龍梅，李亞君，王 燕，牛龍剛，劉 宇，張明升

抑制環(huán)氧合酶對(duì)苯腎上腺素所致大鼠主動(dòng)脈收縮的影響

楊逸童，房龍梅，李亞君，王 燕，牛龍剛，劉 宇，張明升

目的 通過觀察環(huán)氧合酶(COX)抑制劑和血栓素A2(TXA2)受體阻斷藥對(duì)苯腎上腺素(PE)所致大鼠胸主動(dòng)脈收縮的影響，探討前列腺素類物質(zhì)及TXA2受體激動(dòng)在PE所致收縮中的作用。方法 采用Powerlab 血管張力記錄系統(tǒng)記錄肌張力，通過比較用不同抑制劑前后血管對(duì)PE的收縮反應(yīng)的差異，探討PE收縮與前列腺素類物質(zhì)的關(guān)系。結(jié)果 吲哚美辛(10-5mol/L)可顯著抑制PE(10-8mol/L～10-6mol/L)的收縮作用，最大抑制收縮百分比為(46.26±2.54)%，且此作用無內(nèi)皮依賴性；而對(duì)KCl(20 mmol/L～108 mmol/L)的收縮則無顯著影響。COX-1抑制劑(SC-560，10-5mol/L)對(duì)PE的縮血管作用無確切抑制作用，而COX-2抑制劑(NS-398，10-5mol/L)則明顯的抑制PE對(duì)主動(dòng)脈的收縮，最大抑制收縮百分比為(61.83±5.57)%。TXA2阻斷劑對(duì)PE縮血管作用均無顯著影響。 結(jié)論 PE可通過COX，且主要是COX-2，收縮血管。

吲哚美辛；主動(dòng)脈環(huán)；環(huán)氧合酶；血栓素A2；苯腎上腺素

前列環(huán)素(prostaglandin，PG)是存在于動(dòng)物和人體中的一類不飽和脂肪酸組成的，具有多種生理作用的活性物質(zhì)?；ㄉ南┧?arachidonic acid，AA)是這個(gè)大家族的共同前體。AA在生物體內(nèi)主要在磷脂酶A2和磷脂酶C的作用下分解成游離的AA。游離的AA在環(huán)氧合酶(cyclo-oxygenase，COX)作用下，先形成不穩(wěn)定的環(huán)內(nèi)過氧化物(PGG2和PGH2)，隨后PGG2、PGH2又經(jīng)不同的下游酶作用生成各種經(jīng)典型PGs，如PGE2/PGD2和PGF2。除此之外，PGH2還能代謝成為活性更強(qiáng)、生物功能更復(fù)雜的兩種類前列腺素，一種是血栓素A2(thromboxanlA2，TXA2)，另一種是前列環(huán)素I2(prostacylin，PGI2)[1-2]。

吲哚美辛(Indomethacin，Indo)又名消炎痛，為人工合成的吲哚衍生物，是一種較強(qiáng)的非選擇性COX抑制劑，屬非甾體類抗炎藥，具有抗炎、鎮(zhèn)痛及抗血栓的作用。最初主要用于治療風(fēng)濕性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)等。隨著對(duì)吲哚美辛藥理作用研究的深入，逐漸被臨床上用于泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的治療。COX最主要的同工酶是：COX-1、COX-2[3-4]。本課題主要研究Indo是否參與苯腎上腺素(phenylephrine，PE)縮血管作用；如果參與，那么與COX-1、COX-2及其下游產(chǎn)物是否有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 吲哚美辛、COX-1抑制劑(SC-560)、COX-2抑制劑(NS-398)、TXA2抑制劑(SQ-29458、ICI-192605)均購自Sigma公司，PE為上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)，其余試劑均為市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，體重220 g～280 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 BL-420F生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)及張力換能器(澳大利亞埃德國(guó)際貿(mào)易公司)、SartoriusBS124S精密天平(北京賽多利斯生產(chǎn))、PHS-3C精密pH計(jì)(上海雷磁生產(chǎn))、HSS-1B數(shù)字式超級(jí)恒溫泵(成都儀器廠)。

1.4 生理性營(yíng)養(yǎng)液 正常生理鹽水營(yíng)養(yǎng)液PSS成分為：NaCl 144 mmol/L，KCl 5.8 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L，HEPES 5 mmol/L。K-PSS成分為：NaCl 89.8 mmol/L，KCl 60 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L，HEPES 5 mmol/L。上述營(yíng)養(yǎng)液均用2 mol/L NaOH將pH值調(diào)至7.40，預(yù)熱至37 ℃。本實(shí)驗(yàn)所述濃度均為浴管內(nèi)試劑的終濃度。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 大鼠離體主動(dòng)脈環(huán)的制備與基本實(shí)驗(yàn)程序 將雄性大鼠脫臼處死，迅速取出主動(dòng)脈，將其放入O2飽和的4 ℃PSS液中(pH=7.40)。固定好后剔除血管環(huán)周圍組織，并將其剪成2 mm～3 mm的血管環(huán)，用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管腔，一端固定，另一端與張力換能器相連。其靜息張力調(diào)節(jié)為2.2 g，經(jīng)PowerLab生物信號(hào)測(cè)定系統(tǒng)來記錄血管環(huán)張力變化。實(shí)驗(yàn)期間浴管內(nèi)的5 mL液體為持續(xù)通以100%O2、pH值為7.40、37 ℃的PSS。所有動(dòng)脈環(huán)用60 mmol/L KCl多次刺激。當(dāng)標(biāo)本對(duì)刺激穩(wěn)定時(shí)，即連續(xù)2次同樣的刺激所引起的收縮幅度差別<5%時(shí)，開始正式實(shí)驗(yàn)。部分血管環(huán)去內(nèi)皮：用與血管內(nèi)徑相適的棉棒穿過管腔，擦除內(nèi)皮，用60 mmol/L KCl預(yù)收縮血管，收縮達(dá)坪值后，加入Ach(10-5mol/L)，血管環(huán)張力變化幅度<5%時(shí)，可認(rèn)為內(nèi)皮去除完全。

1.5.2 吲哚美辛對(duì)PE縮血管作用的影響 主動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定2 h后，向浴管中累積加入PE，使浴管內(nèi)終濃度分別達(dá)到10-8mol/L、3×10-8mol/L、10-7mol/L、3×10-7mol/L、10-6mol/L，構(gòu)建PE濃度-收縮效應(yīng)曲線。當(dāng)達(dá)最大收縮效應(yīng)時(shí)，用新鮮的PSS沖洗標(biāo)本3次，30 min后重新構(gòu)建PE濃度-收縮效應(yīng)曲線。當(dāng)連續(xù)兩次同樣的刺激所引起的收縮幅度差別<5%時(shí)，向浴管內(nèi)加入Indo，使浴管內(nèi)終濃度達(dá)到10-5mol/L。孵育30 min后，重建PE濃度-收縮效應(yīng)曲線，觀察Indo對(duì)PE縮血管作用的影響。

1.5.3 環(huán)氧合酶選擇性抑制劑對(duì)PE縮血管作用的影響 向浴管內(nèi)分別加入COX-1抑制劑SC-560、COX-2抑制劑NS-398，使浴管內(nèi)終濃度均達(dá)到10-5mol/L，孵育30 min后，在此藥物濃度基礎(chǔ)上重建PE濃度-收縮效應(yīng)曲線，觀察環(huán)氧合酶選擇性抑制劑對(duì)PE縮血管作用的影響。

1.5.4 TXA2阻斷劑對(duì)PE縮血管作用的影響 主動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定2 h后，向浴管中加入PE，使浴管內(nèi)終濃度達(dá)到10-6mol/L，收縮達(dá)坪值后用新鮮的PSS沖洗標(biāo)本3次，30 min后再次加入同濃度的PE，當(dāng)連續(xù)兩次同樣的刺激所引起的收縮幅度差別<5%時(shí)，向浴管內(nèi)分別加入TXA2阻斷劑SQ-29458和ICI-192605，使浴管內(nèi)終濃度均達(dá)到10-5mol/L。孵育30 min后，在此藥物濃度基礎(chǔ)上再次加入終濃度為10-6mol/L的PE，觀察SQ-29458和ICI-192605對(duì)PE縮血管作用的影響。

2 結(jié) 果

2.1 Indo對(duì)PE縮血管作用的影響 無論是內(nèi)皮完整還是去內(nèi)皮，Indo(10-5mol/L)均可顯著抑制PE(10-8mol/L～10-6mol/L)的縮血管作用(P<0.05)，其最大抑制率分別為(46.26±2.54)%和(46.07±11.93)%，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Indo對(duì)KCl(20 mmol/L～108 mmol/L)的縮血管作用則無顯著影響(P>0.05)。詳見圖1。

注：**P<0.05。

2.2 選擇性COX抑制劑對(duì)PE縮血管作用的影響 COX-1抑制劑SC-560(10-5mol/L)對(duì)PE縮血管作用并無確切抑制收縮的作用，COX-2抑制劑NS-398(10-5mol/L)則可顯著抑制PE的縮血管作用(P<0.05)，其最大抑制率為(61.83±5.57)%。詳見圖2。

注：**P<0.05。

2.3 TXA2阻斷劑SQ-29458、ICI-192605對(duì)PE縮血管作用的影響 TXA2阻斷劑SQ-29458、ICI-192605對(duì)PE10-6mol/L所引起的縮血管作用并無顯著的影響(P>0.05)。詳見表1。

表1 SQ-29458、ICI-192605對(duì)PE縮血管作用的影響(±s)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)旨在研究COX抑制劑對(duì)PE所致大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)收縮作用的影響。結(jié)果表明Indo可抑制PE的縮血管作用，且與血管內(nèi)皮無關(guān)。此結(jié)果提示COX參與了PE的縮血管作用。COX有三種同工酶，最主要的是COX-1和COX-2。而Indo是非選擇性COX抑制劑，可同時(shí)抑制COX-1和COX-2。那么，COX-1和COX-2是否均參與了PE的縮血管效應(yīng)呢？本研究進(jìn)一步利用選擇性COX抑制劑來解釋這個(gè)問題。結(jié)果表明，NS-398對(duì)PE引起的主動(dòng)脈收縮有抑制作用，而SC-560幾乎無抑制作用。這就提示COX-2參與了PE的縮血管作用。這與文獻(xiàn)[5]中指出的NS-398抑制PE對(duì)大鼠主動(dòng)脈的收縮作用相符，同時(shí)他們通過放線菌酮實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NS-398發(fā)揮作用與內(nèi)皮無關(guān)，提示COX-2參與PE的收縮作用時(shí)其部位可能位于平滑肌層和主動(dòng)脈外層，免疫印跡結(jié)果也表明在去內(nèi)皮的血管上也能檢測(cè)出COX-2。

COX是前列環(huán)素合成的關(guān)鍵限速酶，可催化AA生成各種前列環(huán)素(如PLC、PLA2、PLD等[6-9])和TXA2。目前認(rèn)為TXA2和PGI2是這些下游產(chǎn)物中活性最強(qiáng)的物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)觀察到TXA2的兩種阻斷劑SQ-29458和ICI-192605對(duì)PE縮血管作用無顯著影響。PGI2對(duì)血管的效應(yīng)與TXA2的作用相反，但具體對(duì)PE收縮大鼠離體主動(dòng)脈血管環(huán)有何影響，仍需通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。也應(yīng)考慮AA的其他代謝產(chǎn)物對(duì)PE縮血管作用有無影響。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)提示COX-2參與PE的縮血管作用。本實(shí)驗(yàn)為離體實(shí)驗(yàn)，環(huán)氧合酶抑制劑在在體動(dòng)物上的作用及機(jī)制仍需更多實(shí)驗(yàn)研究。

[1] Das S，Chandrasekhar S，Yadav JS，et al. Recent developments in the synthesis of prostaglandins and analogues[J]. Chem Rev，2007，107(7)：3286-3337.

[2] Pfister SL. Role of platelet microparticles in the production of thromboxane by rabbit pulmonary artery [J].Hypertension，2004，43(2)：428-433.

[3] Dinchuk JE，Car BD，F(xiàn)ocht RJ，et al.Renal abnormalities and an altered inflammatory response in mice lacking cyclooxygenaseⅡ[J]. Nature，1995，378 (6555)：406.

[4] Oshima M，Dinchuk JE，Kargman SL，et al. Suppression of intestinal polyposis in Apc delta716 knockout mice by inhibition of cyclooxygenase 2(COX-2)[J]. Cell，1996，87(5)：803.

[5] Castillo-Hernandez MC，Guevara-Balcazar G，Lopez-Sanchez P，et al.The influence of constitutive cox-2 in smooth muscle tissue on the contractile effect of phenylephrine in the rat abdominal aorta[J]. Front Biosci (Elite Ed)， 2010，2：441-448.

[6] Burch RM，Luini A，Axelrod J. Phospholipase A2and phospholipase C are activated by distinct GTP-binding proteins in response to á1-adrenergic stimulation in FRTL5 thyroid cells[J]. Proc Natl Acad Sci，1986，83：7201-7205.

[7] Perez D，Hwa J，Gaivin R，et al. Constitutive activation states of a G protein-coupled-receptor[J]. Mol Pharmacol，1996，49：112-122.

[8] Balboa MA，Insel PA. Stimulation of phospholipase D via α1-adrenergic receptors in Madin-Darby canine cells is independent of PKCα and -activation[J]. Mol Pharmacol，1998，53：221-227.

[9] Exton JH. Signaling through phosphatidylcholine breakdown[J].J Biol Chem，1990，265：1-4.

(本文編輯郭懷印)

山西醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新基金(No.01201104)；山西醫(yī)科大學(xué)青年基金(No.02200811)；山西醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金(No.03200707)

山西醫(yī)科大學(xué)(太原 030001)

劉宇，E-mail：solayyt@sina.com

R331

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2016．04．009

1672-1349(2016)04-0364-03

2015-09-12)