馬莉莉，倪宏波

牛呼吸道合胞體病毒流行病學(xué)的研究

馬莉莉，倪宏波?

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319）

牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）是一種有包膜單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科中肺病毒屬病毒成員。自從20世紀(jì)70年代初BRSV被確認(rèn)為是牛犢中引起呼吸道疾病的主要原因。眾多免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法的出現(xiàn)方便BRSV的研究。盡管如此，流行病學(xué)、分子流行病學(xué)和病毒的進(jìn)化等許多方面仍然沒(méi)有完全了解。自然感染過(guò)程的復(fù)雜使診斷更難，急需更好的治療預(yù)防措施控制疾病。了解BRSV才能夠建立感染機(jī)制，才能防止病毒和疾病的傳播。本文綜述了有關(guān)BRSV流行病學(xué)和分子流行病學(xué)的重要信息，并突出了病毒進(jìn)化在病毒傳播中的重要性。

牛呼吸道合胞病毒；全球分布；基因型；演化

1 簡(jiǎn)介

牛呼吸道合胞體病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）是主要在犢牛中引起一種急性呼吸道綜合征的病原體，由于高的發(fā)病率、死亡率和治療成本，導(dǎo)致BRSV感染生產(chǎn)損失和經(jīng)濟(jì)損失[1]。BRSV是一種有包膜、非分段、負(fù)鏈的RNA，副黏液病毒科，肺病毒亞科，肺病毒屬成員。病毒體含有三種表面糖蛋白（糖蛋白[G]、融合蛋白[F]和小疏水蛋白[SH]）。包膜由核蛋白（N）、磷蛋白（P）組成的螺旋形核衣殼，病毒RNA依賴(lài)性聚合酶蛋白（L）的M蛋白和稱(chēng)作M2-1轉(zhuǎn)錄抗終止因子，基因組RNA（約15 000個(gè)核苷酸）也編碼RNA調(diào)控蛋白M2-2和兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1和NS2[2]。

BRSV和人類(lèi)呼吸道合胞病毒（HRSV）密切相關(guān)，兩種病毒之間的流行病學(xué)有相似之處也有差異[3]。兩種病毒之間的相似性為揭示BSRV可致病性提供便利的研究機(jī)制，近年來(lái)對(duì)于全球流行病學(xué)和BRSV分子流行病學(xué)了解已顯著提高，研究BRSV流行病學(xué)和分子流行病學(xué)的各個(gè)方面，以及病毒進(jìn)化之間的關(guān)系。

2 流行病學(xué)

BRSV感染在世界傳播廣泛，牛最易感染，綿羊也可被感染，傳染率通常相當(dāng)高，可以在畜群之間進(jìn)行病毒傳播。牛群之間局部擴(kuò)散和空氣傳播對(duì)畜群間傳播并不是非常重要，畜群的直接傳輸通常會(huì)導(dǎo)致感染新動(dòng)物，而間接傳輸是由人群攜帶進(jìn)行傳播，BRSV通常在冬季暴發(fā)，血清感染的陽(yáng)性率在不同區(qū)域良莠不齊[4]。發(fā)病率相當(dāng)高，某些情況乳牛群中臨床呼吸疾病高達(dá)60%。BRSV可以成為影響各年齡動(dòng)物的流行病，接觸病毒的畜群傾向于感染更年輕的動(dòng)物和易感動(dòng)物。種群內(nèi)病毒的生存機(jī)制尚不完全清楚，可從無(wú)癥狀的動(dòng)物中分離病毒并持續(xù)數(shù)月，也會(huì)持續(xù)感染相對(duì)孤立狀態(tài)下的小牛[5]，可能由于發(fā)生潛伏感染造成的。據(jù)報(bào)道牛亞臨床感染不保證BRSV的持久性，認(rèn)為感染來(lái)源于臨床帶病動(dòng)物，旨在評(píng)估病毒傳播的持久性，以充分理解BRSV的傳輸機(jī)制。

在北美患病率很大，1970年初美國(guó)研究表明成年牛中67%的感染率，無(wú)癥狀牛血清陽(yáng)性率高達(dá)95%[6]。血清陽(yáng)性率似乎與宿主年齡密切相關(guān)，在老年動(dòng)物中發(fā)病率較高，美國(guó)南部地區(qū)普遍表現(xiàn)出更高的血清陽(yáng)性率相比于北部地區(qū)。而其他病毒，如牛病毒性腹瀉和副流感病毒也提高了死亡率。在歐洲大陸傳播情況下，從瑞典南部地區(qū)的樣品中觀察到牛奶樣品中高的抗體頻率，北部樣品檢測(cè)率較低，表明BRSV感染主要發(fā)生在瑞典中西部和南部地區(qū)。丹麥報(bào)道BRSV感染率（54%）相當(dāng)高[7]，在比利時(shí)觀察到BRSV感染的高流行性，在英格蘭報(bào)道散裝罐牛奶樣品中存在抗體。在非洲，埃塞俄比亞和南非也證明有高發(fā)率的BRSV感染，高血清陽(yáng)性率也與設(shè)施有關(guān)，有機(jī)農(nóng)場(chǎng)相比于傳統(tǒng)農(nóng)場(chǎng)表現(xiàn)出較低抗體。因此，需要更多的信息來(lái)了解地理區(qū)域病毒存活的機(jī)制，此外對(duì)于牛群爆發(fā)的監(jiān)測(cè)可以提供更有價(jià)值的信息，幫助了解BRSV感染的流行病學(xué)。

3 分子流行病學(xué)

有關(guān)BRSV感染的分子流行病學(xué)的資料有限，但DNA測(cè)序可能有助于揭開(kāi)BRSV傳輸?shù)姆肿訖C(jī)制，系統(tǒng)遺傳學(xué)可以確定不同基因型BRSV的親緣關(guān)系，同時(shí)了解BRSV的分子基礎(chǔ)，以及用于研究BRSV起源和后續(xù)演進(jìn)。最新序列信息有助于了解BRSV感染模式[8]，目前進(jìn)化方法方便促進(jìn)研究新毒株的起源，病毒重組的鑒定，群體大小的出現(xiàn)，病毒傳播以及演變。分子流行病學(xué)方法提供關(guān)于BRSV演化的重要見(jiàn)解，病毒分子流行病學(xué)的研究很可能會(huì)提高病毒傳播的動(dòng)態(tài)。BRSV分離物中出現(xiàn)抗原的變異，針對(duì)特定病毒株的多克隆血清缺乏建議，沒(méi)有認(rèn)識(shí)到不同分離物之間的反應(yīng)，此外也可以推斷一些結(jié)構(gòu)蛋白的分子大小，暗示BRSV是由不同的亞組組成。BRSV存在多樣性，在開(kāi)創(chuàng)性研究中，BRSV中表現(xiàn)出不同識(shí)別模式，表明抗原的多樣性，雖然BRSV疫苗有很多功效，但疫苗的失敗可能是歸因于BRSV更廣泛的抗原譜，報(bào)告也認(rèn)為有兩種不同BRSV亞組的存在。

BRSV的分子流行病學(xué)研究始于核苷酸糖蛋白（G）、融合蛋白（F）、核衣殼（N）、基質(zhì)（M）、磷蛋白（P），20世紀(jì)90年代初疏水性（SH）和M2蛋白初步評(píng)價(jià)了兩個(gè)菌株之間P蛋白的同源性，顯示有97%同一性的核苷酸水平[9]。隨后分析有限數(shù)量的核苷酸變異G蛋白的水平，表明BRSV菌株之間的同一性的水平介于84%和95%。這種程度的異質(zhì)性表明只存在單一基因組。BRSV株之間抗原異質(zhì)性和分子多樣性之間的直接比較表明抗原性差異是亞組間變化的結(jié)果，在野生BRSV菌株也證實(shí)存在抗原變異。

通過(guò)單克隆抗體識(shí)別G蛋白部分核苷酸序列，對(duì)抗BRSV G、F、N和P蛋白表明分離株隨機(jī)抗原的差異性。觀察病毒蛋白存在表位交叉反應(yīng)，特別是F蛋白。此外觀察F蛋白和P蛋白結(jié)構(gòu)上存在差異，P蛋白表現(xiàn)出多樣性，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時(shí)分子大小表現(xiàn)差異，與抗原相關(guān)的F、N蛋白沒(méi)有觀察到和P蛋白結(jié)構(gòu)上的差異。G蛋白的核苷酸序列同一性介于94.1%～99.9%。相比較而言，預(yù)測(cè)的氨基酸序列同源性范圍為89.9%～99.6%，認(rèn)為BRSV屬于一個(gè)單系群[10]。

更全面的研究分析針對(duì)BRSV G蛋白的反應(yīng)模式，從不同地理區(qū)域分離的G蛋白基因段發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性，表明BRSV株之間組內(nèi)遺傳變異88%～100%之間[11]。相應(yīng)系統(tǒng)遺傳分析表明存在兩個(gè)主要分支，分支被進(jìn)一步細(xì)分為兩組，Ia和Ib，再分成五個(gè)不同譜系，每個(gè)代表一個(gè)集群，Ia族所含毒株屬于抗原亞組A；而分支Ib包括歐洲血統(tǒng)屬于亞組B；分支Ⅱ，分類(lèi)為抗原亞組B；第三個(gè)集群包括斯堪的納維亞株[11]。間接觀察進(jìn)化樹(shù)和一些菌株之間的抗原模式關(guān)系認(rèn)為BRSV屬于單個(gè)抗原組，與研究組有不同的遺傳變異體。瑞典和丹麥之間的比較分析表明，瑞典株的還原序列多樣性可能是瑞典封閉欄中奶牛的有限進(jìn)口造成的，這些發(fā)現(xiàn)認(rèn)為母牛進(jìn)口增加了區(qū)域BRSV譜系核苷酸序列的多樣性。

一項(xiàng)大規(guī)模研究歐洲、北美BRSV的分子流行病學(xué)和進(jìn)化，該研究評(píng)估了N、F和G蛋白的核苷酸多樣性，并分析氨基酸序列以及它們的親緣關(guān)系。百分比為G蛋白基因（8%），N和F蛋白的基因最低（2%）[12]。一般來(lái)說(shuō)，在所有BRSV蛋白中觀察到同區(qū)域內(nèi)動(dòng)物的同源性，其中N和G蛋白基因序列中檢測(cè)到的基因序列的差異，表明單個(gè)病毒或密切相關(guān)的病毒會(huì)在給定時(shí)間內(nèi)傳染指定的畜群。在系統(tǒng)遺傳分析基礎(chǔ)上，G蛋白質(zhì)序列分成六個(gè)不同的組，進(jìn)行N和F蛋白基因序列的分析；觀察到任一蛋白質(zhì)只有五個(gè)聚類(lèi)組。如預(yù)期的一樣，BRSV序列的特征聚類(lèi)是根據(jù)地理來(lái)源區(qū)別的，進(jìn)一步觀察確定地理和時(shí)間聚類(lèi)的理論。在1976年前歐洲分離出亞群I，美國(guó)的病毒分離出亞組Ⅲ。從北歐、丹麥和瑞典株發(fā)現(xiàn)亞組Ⅱ呈簇狀，荷蘭、比利時(shí)和法國(guó)分別發(fā)現(xiàn)亞組Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ[13]。研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物感染用BRSV疫苗的免疫接種失敗，表明商業(yè)疫苗對(duì)抗感病毒染效果不佳，此外觀察到BRSV的N、G和F蛋白的演變，可能與不同國(guó)家疫苗接種相關(guān)，在G蛋白、N和F蛋白的特定區(qū)域都有強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng)等。法國(guó)BRSV分離株列入本研究還顯示保守中央疏水部位于突變G蛋白胞外域[14]，形成四個(gè)Cys殘基、兩個(gè)二硫鍵、一個(gè)螺旋，這些對(duì)G蛋白的三維結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，高度保守區(qū)域不斷修改免疫G蛋白，增加BRSV在疫苗發(fā)展上的重要性?？傮w來(lái)說(shuō)現(xiàn)代分子流行病學(xué)為研究不同區(qū)域BRSV分子流行病學(xué)模式建立了基礎(chǔ)。BRSV已被證明作為病毒復(fù)雜混合物變種的存在，稱(chēng)為不確定的“變異種”。在臨床分離株BRSV G蛋白基因的分析中證明亞群的共存性，克隆分析G-編碼區(qū)的核苷酸異質(zhì)性表現(xiàn)出每個(gè)核苷酸突變頻率范圍是從6.8×104到10.1×104進(jìn)行替換[15]，結(jié)果表明，BRSV種群進(jìn)化的復(fù)雜和動(dòng)態(tài)性，盡管這種病毒遺傳有明顯的穩(wěn)定性。

在牛群間相同病毒的循環(huán)通過(guò)分子流行病學(xué)途徑表現(xiàn)出來(lái)，特別是疾病暴發(fā)期間。然而病毒株復(fù)發(fā)性也會(huì)發(fā)生顯著變化（高達(dá)11%），在牛群中不同BRSV的循環(huán)變異會(huì)持續(xù)感染小牛。由于病毒進(jìn)化，新的高強(qiáng)度病毒成為主體傳播給動(dòng)物，高水平多樣性的爆發(fā)可能表明BRSV是從外引進(jìn)新病毒株的結(jié)果[16]。所有研究集中于基因編碼G蛋白核苷酸序列的研究，通過(guò)G蛋白獲得的信息已經(jīng)用于了解BRSV的序列，區(qū)域所提供的序列信息用于表明病毒株。未來(lái)研究會(huì)分析更多BRSV部分，以及病毒基因組的全長(zhǎng)，這些將有可能為該病毒株提供更準(zhǔn)確的理解。BRSV全球分子流行病學(xué)研究一直難以實(shí)現(xiàn)，目前少量文獻(xiàn)報(bào)告提供了BRSV的分布情況。分子BRSV的表征區(qū)域在世界仍然是相當(dāng)不完整，日本在21世紀(jì)初進(jìn)行一項(xiàng)關(guān)于亞群菌株循環(huán)的研究，該菌株被進(jìn)一步細(xì)分為兩個(gè)不同譜系[17]，但這項(xiàng)研究只有極少數(shù)菌株，并未全面了解該地區(qū)BRSV的分子流行病學(xué)的研究。巴西研究確定少量BRSV B組毒株，另一項(xiàng)研究表明英國(guó)分離株基因和美國(guó)毒株有關(guān)，兩份報(bào)告都表明BRSV流行病學(xué)對(duì)全球進(jìn)口活牛分子研究起的重要作用[18]。

綜上所述，在過(guò)去二十年中BRSV的分子流行病學(xué)研究有很大發(fā)展。分子特性的研究以及BRSV株系統(tǒng)遺傳和進(jìn)化已經(jīng)推進(jìn)我們對(duì)于病毒和疾病傳播的分子機(jī)制的研究，但該領(lǐng)域仍然需要廣泛的研究來(lái)揭示病毒的持久性。BRSV在不同地理區(qū)域的分子監(jiān)控的建立將有可能提高病毒暴發(fā)的識(shí)別，預(yù)防措施為了控制病情。新一代測(cè)序“DNA測(cè)序時(shí)代”可以發(fā)現(xiàn)宿主的病毒復(fù)制和生存的基本能力。

4 結(jié)束語(yǔ)

BRSV被認(rèn)為是近幾十年中引起牛呼吸系統(tǒng)疾病的重要病因，病毒基因組特異性和復(fù)制低保真度維持病毒在宿主內(nèi)的生存和持續(xù)性。從臨床標(biāo)本中分離的病毒菌株，病毒顆粒通常有不穩(wěn)定性，但分子生物學(xué)的方法可以成為BRSV在臨床上正確識(shí)別和鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，BRSV在分子流行病學(xué)領(lǐng)域取得的顯著的進(jìn)步，可以增強(qiáng)我們?cè)谌駼RSV的分布和傳輸模式上的了解?？傊?，新分子學(xué)方法包括新一代測(cè)序的到來(lái)，將可能幫助揭開(kāi)不同地理區(qū)域病毒基因的組成，以及病毒持久性傳播的機(jī)制。

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Epidemiology,Molecular Epidemiology of Bovine Respiratory SyncytialVirus

Ma Lili,Ni Hongbo*
(College of animal science and technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

Bovine respiratory syncytial virus(BRSV)is an enveloped single strand RNA virus, the virus belongs to the members of the family Paramyxoviridae pneumovirus.Since the beginning of 1970s BRSV was confirmed to be the main reason of respiratory disease caused by the calf.Research facility BRSV many immunological and molecular biological methods.In spite of this in many ways,epidemiology,molecular epidemiology and the evolution of the virus is still not fully understood.The natural infection process complex and make the diagnosis more difficult,treatment needs better preventive measures to control the disease.Understanding BRSV infection to be able to establish a mechanism to prevent the spread of virus and disease.This paper reviews the important information about the epidemiology and molecular epidemiology of BRSV the virus evolution and highlighted the importance of transmission of the virus.

Bovine respiratory syncytial virus;Global distribution;Genotype;Evolution

S858.23

A

1672-9692(2016)11-0037-04

2016-10-09

馬莉莉（1992-）,女，黑龍江人，在讀碩士，研究方向?yàn)榉肿蛹?xì)菌學(xué)和免疫學(xué)。

倪宏波（1972-）,男，黑龍江人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)研究。