宋穎劼，劉明章，鐘華杰，陸群英，戴利成

顆粒蛋白前體在皮膚鱗癌A431細(xì)胞中的表達(dá)及其作用研究

宋穎劼，劉明章，鐘華杰，陸群英，戴利成

目的探討顆粒蛋白前體（PGRN）在皮膚鱗癌A431細(xì)胞中的表達(dá)及其對生長轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。方法構(gòu)建PGRN干擾細(xì)胞株，通過增殖（CCK-8）實(shí)驗(yàn)和侵襲（Trans-well）實(shí)驗(yàn)分別研究PGRN在皮膚鱗癌A431細(xì)胞的增殖和侵襲中的作用，探討PGRN在皮膚鱗癌生長及轉(zhuǎn)移中的意義。結(jié)果成功構(gòu)建了PGRN-shRNA-A431細(xì)胞株，并通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和Trans-well實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了干擾PGRN后對皮膚鱗癌A431細(xì)胞的生長及侵襲具有抑制作用。結(jié)論P(yáng)GRN在皮膚鱗癌A431細(xì)胞中表達(dá)，并與皮膚鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

顆粒蛋白前體；皮膚鱗癌；A431細(xì)胞

皮膚癌為臨床常見的惡性腫瘤之一，為白種人常見的惡性腫瘤，甚至超過其他惡性腫瘤的總和。流行病學(xué)調(diào)查表明：由于臭氧層的破壞和人們戶外活動的增多，皮膚癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，僅在美國每年新診斷皮膚癌患者約130萬例[1]，在澳大利亞南部地區(qū)，皮膚癌的發(fā)病率達(dá)650/10萬，在美國的高加索人中，皮膚癌的發(fā)病率亦高達(dá)165/10萬[2]。本研究觀察顆粒蛋白前體（PGRN）在皮膚鱗癌細(xì)胞 A431中的表達(dá)及其與皮膚鱗癌細(xì)胞增殖和遷移的相關(guān)性?，F(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料細(xì)胞培養(yǎng)：人皮膚鱗癌細(xì)胞A431，人胚腎細(xì)胞293T購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。胎牛血清（FBS）、D MEM培養(yǎng)基、0.025%胰蛋白酶、青鏈霉素和嘌呤霉素均購自美國Gibco公司。

1.2方法A431細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.1shRNA干擾病毒的構(gòu)建與包裝

本實(shí)驗(yàn)針對PGRN序列設(shè)計(jì)shRNA序列克隆至帶有 EGFP報告基因的GV248載體進(jìn)行病毒載體構(gòu)建。將構(gòu)建成功的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒PGRN-shRNAGV248與其他兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒、三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用說明進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。293T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染前24 h，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，PBS液洗滌一次，更換為含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察報告基因GFP的表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞上清液，將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，－80℃長期保存。

1.2.2shRNA干擾PGRN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建PGRN抗體及GAPDH抗體均購自美國SantaCruze公司，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株按照說明書操作。PGRN及GAPDH抗體 A431細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%FBS的DMEM 培養(yǎng)液中至對數(shù)生長期，用0.025%的胰蛋白酶消化，按5×105個細(xì)胞/ml接種于12孔板中，培養(yǎng)過夜后按照MOI 20感染A431細(xì)胞，同時設(shè)立對照組，48 h后，將培養(yǎng)基換成含5g/ml嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞篩選，以后隔天更換含5g/ml嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基，10～12 d后，0.025%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，將其按1個細(xì)胞/100l培養(yǎng)液接種于96孔板，1周后，挑選單克隆株，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。Western Blot鑒定陽性克隆株，并挑選生長良好的單克隆株凍存及用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)A431細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，用0.025%的胰蛋白酶分別消化對數(shù)生長期的 PGRN-shRNA-A431細(xì)胞、ControlshRNA-A431細(xì)胞及A431細(xì)胞，以每孔5×103個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為100 l，各組細(xì)胞分別做6個復(fù)孔。將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，48h后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）10l，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 l DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸收值，記錄結(jié)果。

1.2.4細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)A431細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，按照24孔比色法檢測細(xì)胞侵襲能力試劑盒[QCMTM24-Well Colorimetric Cell InvasionAssayKit（CHEMICON）]的說明書要求進(jìn)行操作，用0.025%的胰蛋白酶分別消化對數(shù)生長期的PGRN-shRNA-A431細(xì)胞、Control-shRNA-A431細(xì)胞及A431細(xì)胞，將細(xì)胞按5×105/ml接種于小室，48h后，對細(xì)胞進(jìn)行染色，在普通倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，并檢測細(xì)胞裂解液在560 nm下的吸光值，對其定量。

1.3統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用-檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PGRN干擾細(xì)胞株P(guān)GRN-shRNAA431的構(gòu)建及鑒定通過慢病毒感染及嘌呤霉素篩選，成功得到A431被干擾的穩(wěn)定細(xì)胞株P(guān)GRN-shRNA-A431。抽提細(xì)胞蛋白后，通過WesternBlot驗(yàn)證了PGRN的表達(dá)，PGRN-shRNA-A431細(xì)胞株幾乎不表達(dá)PGRN蛋白（封四彩圖3）。

2.2PGRN促進(jìn)A431細(xì)胞的增殖和侵襲

通過CCK-8實(shí)驗(yàn)，PGRN-shRNA-A431細(xì)胞吸光值（0.325±0.05）與 ControlshRNA-A431細(xì)胞（0.768±0.12）和A431細(xì)胞（0.785±0.15）比較，其細(xì)胞增殖效率發(fā)生顯著降低（均＜ 0.05），而 ControlshRNA-A431細(xì)胞和A431細(xì)胞比較，其細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。

通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，PGRN-shRNAA431細(xì)胞吸光值（0.125±0.013）與ControlshRNA-A431細(xì)胞（0.232±0.042）和A431細(xì)胞（0.257±0.028）比較，其細(xì)胞侵襲效率發(fā)生顯著降低（＜0.05）（封四彩圖4），而ControlshRNA-A431細(xì)胞和A431細(xì)胞比較，其細(xì)胞侵襲率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。

3　討論

皮膚癌主要分為3種：基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和惡性黑色素瘤，其中基底細(xì)胞癌最多見，占60%以上，鱗狀細(xì)胞癌約占30%，平常所說的皮膚癌主要是指這兩種[3]。皮膚癌的發(fā)病率雖然逐年上什，但目前臨床治療方法仍存在許多弊端，如激光外科雖操作簡單，費(fèi)時少，但其費(fèi)用高，而且有時不易掌握破壞范圍，易導(dǎo)致正常組織損傷和治療不徹底易復(fù)發(fā)等；冷凍外科本身雖不會帶來疼痛，但解凍后的組織易產(chǎn)生疼痛、腫脹和滲出等炎性反應(yīng)，形成瘢痕；目前臨床常用的40種化療藥物靶向性低且選擇性不強(qiáng)，在殺傷大部分腫瘤細(xì)胞的同時對正常組織細(xì)胞殺傷作用也較大。因此，尋找一種新的防治皮膚癌的方法是廣大醫(yī)學(xué)工作者的當(dāng)務(wù)之急。

許多研究發(fā)現(xiàn)，大部分器官中都有PGRN基因的表達(dá)，包括皮膚組織、胃腸道系統(tǒng)、女性生殖器官和乳腺上皮組織等[4]。研究發(fā)現(xiàn)PGRN蛋白在多種腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌細(xì)胞[5]、卵巢癌細(xì)胞[6]、腎上腺皮質(zhì)瘤細(xì)胞[7]和前列腺癌細(xì)胞[8]中，都有明顯的高表達(dá)，它在調(diào)解腫瘤細(xì)胞的生長、增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力和促進(jìn)腫瘤組織血管形成等方面發(fā)揮重要作用，提示PGRN可能成為腫瘤治療的良好靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，PGRN在皮膚鱗癌細(xì)胞A431中表達(dá)顯著，因此推測其可能對皮膚鱗癌細(xì)胞的生長和侵襲具有重要作用。因此，構(gòu)建成功了PGRN的干擾病毒，并將此病毒感染A431細(xì)胞，從而獲得了PGRN干擾的A431穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，通過該細(xì)胞模型研究PGRN在A431生長過程中調(diào)控作用。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)，PGRN干擾后，A431細(xì)胞的生長受到明顯的抑制，與未處理A431細(xì)胞相比較，其增殖抑制率達(dá)到58.6%，而對照病毒處理組與未處理的A431細(xì)胞相比較，增殖抑制率無顯著差異。而通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，筆者還發(fā)現(xiàn)，PGRN干擾后，A431細(xì)胞的侵襲能力也發(fā)生了顯著的降低，與未處理的A431細(xì)胞相比較，其侵襲抑制率達(dá)到51.4%，而對照病毒處理組與與未處理的A431細(xì)胞相比較，侵襲抑制率無顯著差異。

PGRN促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等作用受到細(xì)胞內(nèi)外信號的嚴(yán)密控制。當(dāng)細(xì)胞外因素刺激或細(xì)胞本身的生理功能發(fā)生變化時，PGRN可通過多條信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮其生理功能。目前，大量研究表明，PGRN主要通過以下幾條信號通路發(fā)揮作用：（1）SHC和P44/42MAPK參與的胞外調(diào)節(jié)激酶信號傳導(dǎo)途徑[7]；（2）PI3K、PKB/AKT和P70s6kinase參與的 PI3K信號傳導(dǎo)途徑。PGRN主要通過以上兩條信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能[8]；PGRN還可以促使粘著斑激酶（FAK）上的酪氨酸磷酸化[9]。FAK主要參與調(diào)節(jié)整合素以及細(xì)胞骨架蛋白的信號通路，因此，PGRN通過活化FAK，從而激活整合素信號傳導(dǎo)通路，發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和抵抗失巢凋亡的功能。

目前PGRN在皮膚組織中的研究報道還很少，PGRN在表皮細(xì)胞中有表達(dá)，在皮膚癌細(xì)胞A431中高表達(dá)。但是，其具體的作用及調(diào)控機(jī)制還不是很明確。因此，研究PGRN在皮膚癌細(xì)胞生長中的作用，探索其調(diào)控細(xì)胞生長的機(jī)制，對于進(jìn)一步了解PGRN在皮膚生長發(fā)育及皮膚癌生長轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制具有重要意義。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.05.052

R365；R75

A

1671-0800(2016)05-0661-02

2016-01-10

（本文編輯：陳志翔）

浙江省湖州市科技局一般項(xiàng)目（2012YS09）

313000，浙江省湖州，湖州市中心醫(yī)院

宋 穎 劼，Email：songyingjiehz@126.com