李丹，汪偉，祝文斌，林高品浙江省杭州市亞慧生物科技有限公司，浙江杭州　310052

一種人血白蛋白和聚乙二醇衍生物水凝膠的制備與性能研究

李丹，汪偉，祝文斌，林高品
浙江省杭州市亞慧生物科技有限公司，浙江杭州310052

目的以人血白蛋白和聚乙二醇衍生物為主要成份構(gòu)建了外科手術(shù)封合劑水凝膠。方法抽取該院2015年8月—2016年5月收集的人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝膠在5 d后即能降解60%，在12 d時(shí)僅殘余少量水凝膠，具有良好的生物降解性。脹破強(qiáng)度試驗(yàn)結(jié)果顯示聚人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝膠的脹破強(qiáng)度（16.5± 4.1）kPa顯著高于外用凍干人纖維蛋白粘合劑（1.3±1.0）kPa。結(jié)果L929細(xì)胞在人血白蛋白/聚乙二醇衍生物凝膠浸提液中形態(tài)正常，MTT檢測(cè)表明人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝膠無(wú)潛在的細(xì)胞毒性。 結(jié)論聚乙二醇衍生物和人血白蛋白凝膠具有凝膠速度快、脹破強(qiáng)度高、組織粘附性好和細(xì)胞毒性低的特點(diǎn)，人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝膠為肺部外科手術(shù)后封合提供了一種新的選擇。

白蛋白；聚乙二醇衍生物；水凝膠；封合劑

［Abstract］Objective to establish a surgical sealant based on the Human Albumin and polyethylene glycol derivatives as the main components.Methods From August 2015 to May 2016 the Human Albumin/PEG derivative hydrogel was able to degrade 60%after 5 d，with only a small amount of hydrogel in 12 d，which had good biodegradability.The bursting strength test results showed that the bursting strength（16.5+4.1）kPa was significantly higher than that of the freeze-dried human fibrin adhesive（1.3±1.0）kPa.Results The morphology of L929 cells was normal in the gel extract of Human Albumin/，and the MTT test showed that there was no potential cytotoxicity of the.Conclusion Poly（ethylene glycol）derivatives and human serum albumin gel with gel speed，bursting strength high，tissue adhesion and low cytotoxicity，human serum albumin/polyethylene glycol derivative hydrogels after lung surgery letter provided the a new selection add Conclusion.

［Key words］Albumin，Polyethylene glycol derivatives，Hydrogel，Sealing agent

肺部手術(shù)后漏氣是肺切除和胸膜剝脫術(shù)等胸部手術(shù)后常見并發(fā)癥［1］。漏氣可能會(huì)引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括支氣管胸膜瘺、延長(zhǎng)胸腔引流置管時(shí)間引起的感染、延長(zhǎng)恢復(fù)時(shí)間和增加住院費(fèi)用等。纖維蛋白膠、氰基丙烯酸酯、GRF（甲醛交聯(lián)的明膠-間苯二酚）、GR FG（戊二醛和甲醛交聯(lián)的明膠-間苯二酚）等材料已經(jīng)用于外科手術(shù)封合或止血，也被用于肺部手術(shù)后防止漏氣，但是效果并不明顯。聚乙二醇在藥物修飾、藥物載體、生物材料表面修飾以及水凝膠領(lǐng)域都有廣泛的研究與應(yīng)用。基于人血白蛋白和聚乙二醇衍生物（聚乙二醇二琥珀酰亞胺琥珀酸酯，PEG-SS2）開發(fā)了一種新型外科手術(shù)封合凝膠，并對(duì)該凝膠作為肺部外科手術(shù)封合劑的可能性做了初步探索。

1　試驗(yàn)

1.1試劑與儀器

PEG-SS2購(gòu)于北京凱正生物工程發(fā)展有限責(zé)任公司。人血清白蛋白（25%）購(gòu)于奧地利奧克特琺瑪藥劑生產(chǎn)有限公司。外用凍干人纖維蛋白粘合劑購(gòu)于上海萊士血液制品股份有限公司。風(fēng)干腸衣為市售。UV-5300型紫外可見光分光光度計(jì)，脹破強(qiáng)度檢測(cè)采用自制設(shè)備。

1.2試驗(yàn)過(guò)程

1.2.1凝膠時(shí)間檢測(cè)采用試管翻轉(zhuǎn)法檢測(cè)凝膠時(shí)間。將聚乙二醇衍生物溶于緩沖液，分別配置成50、100、200 mg/mL和400 mg/mL的溶液。0.5 mL的人血清白蛋白溶液與0.5 mL的聚乙二醇衍生物溶液在1.5 mL離心管中混合?；旌虾箝_始計(jì)時(shí)，每隔5 S翻轉(zhuǎn)離心管，直至離心管內(nèi)液體不能流動(dòng)，此時(shí)的時(shí)間即為凝膠時(shí)間。

1.2.2溶脹性能檢測(cè)將1 mL人血清白蛋白溶液與1 mL聚乙二醇衍生物溶液混合后，澆注到長(zhǎng)25 mm× 寬25 mm×深3 mm的模板中，形成凝膠后，取一定質(zhì)量（W0）的凝膠放入離心管中，按照1 g/10 mL浸泡在0.1 M的PBS，在37℃水浴中孵化4 h。取出凝膠，用濾紙吸干表面水份后稱重，稱量其質(zhì)量為W1，凝膠溶脹度計(jì)算公式為：溶脹度=（W1-W0）/W0×100%。

1.2.3體外降解 將1 mL人血白蛋白溶液與1 mL聚乙二醇衍生物溶液混合后，噴涂到長(zhǎng)25 mm×寬25 mm× 深3 mm的模板中，形成凝膠后，取一定重量的人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝膠，置于聚四氟乙烯板上，冷凍干燥至恒重（W0），將凍干后的凝膠放入離心管中，按照1 g/10 mL的比例浸泡在0.1 M PBS水中，在37℃水浴中孵化。每隔24 h取出凝膠，冷凍干燥后稱重（Wt），記錄凝膠的質(zhì)量變化，凝膠的重量保持率=Wt/W0×100%。

1.2.4細(xì)胞毒性 細(xì)胞毒性試驗(yàn)是用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。該次試驗(yàn)是按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993.5-2009《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》的MTT法進(jìn)行的。無(wú)菌條件下，將所有溶液分別用0.22 μm濾頭過(guò)濾除菌；將水凝膠按照1 g/10 mL的比例浸提于MEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、濕度為100%的恒溫培養(yǎng)箱中孵化24 h，得到浸提液。在此次試驗(yàn)條件下，該外科手術(shù)封合劑100%試驗(yàn)液為試驗(yàn)組1，50%試驗(yàn)液為試驗(yàn)組2，25%試驗(yàn)液為試驗(yàn)組3，12.5%試驗(yàn)液為試驗(yàn)組4。陽(yáng)性對(duì)照為10%DMSO溶液。陰性對(duì)照為高密度聚乙烯按每0.2 g陰性對(duì)照加1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基的比例，在60 rpm條件下（37±1）℃，浸提（24±2）h。介質(zhì)對(duì)照為不含試驗(yàn)液的細(xì)胞培養(yǎng)基，處理同試驗(yàn)組。將樣品試驗(yàn)液，陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照的浸提液及介質(zhì)對(duì)照分別放于6個(gè)培養(yǎng)著L929小鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，在5% CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后顯微鏡下觀察試驗(yàn)樣品組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及介質(zhì)對(duì)照組培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并用MTT法測(cè)定各供試品組（樣品組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組）相對(duì)于介質(zhì)對(duì)照組的細(xì)胞存活率。

2　結(jié)果與討論

2.1凝膠時(shí)間

外科手術(shù)封合凝膠前體溶液，噴涂到在體內(nèi)形成凝膠，如果凝膠化時(shí)間過(guò)快，有可能還沒(méi)完全注射入體內(nèi)，就形成凝膠，不利于臨床操作；如果凝膠化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，注射入體內(nèi)后會(huì)在組織創(chuàng)面流動(dòng)，甚至可能被體液稀釋，無(wú)法凝膠。聚乙二醇衍生物PEG-SS2與人血白蛋白溶液混合后，PEG-SS2活化端基和人血白蛋白組分自由氨基形成酰胺鍵，交聯(lián)形成水凝膠。交聯(lián)劑濃度增加，凝膠速度增加。PEG-SS2濃度為25mg/mL時(shí)，90 S以后未形成凝膠，溶液變粘稠；PEG-SS2濃度為50mg/mL時(shí)，凝膠時(shí)間為50 s；PEG-SS2濃度為100 mg/mL時(shí)，凝膠時(shí)間為20 s；PEG-SS2濃度為200 mg/mL時(shí)，凝膠時(shí)間為15 s；PEG-SS2濃度為400 mg/mL時(shí)，凝膠時(shí)間為15 s。交聯(lián)劑PEG-SS2濃度由25 mg/mL增加到100 mg/mL，PEG-SS2活性端基濃度也越高，凝膠時(shí)間越短。PEG-SS2濃度達(dá)到200 mg/mL，凝膠時(shí)間變化不明顯，在此后的研究中，PEG-SS2濃度設(shè)定為200 mg/mL。

2.2溶脹性能

溶脹性是指凝膠吸收液體后自身體積明顯增大的現(xiàn)象，是表征生物材料吸水性能比較簡(jiǎn)單的方法［2］。該研究采用凝膠吸水后的質(zhì)量變化百分比來(lái)反應(yīng)凝膠的溶脹性能。凝膠吸水后質(zhì)量增加。隨著凝膠前體溶液中PEG-SS2的濃度增加，溶脹比呈減少趨勢(shì)，由50 mg/mL的196%降低到400 mg/mL的65%，可能的原因是高濃度交聯(lián)劑條件下形成了更多的交聯(lián)點(diǎn)，限制了凝膠的溶脹。

2.3粘彈性

從粘彈性檢測(cè)結(jié)果可以看出，PEG-SS2濃度為200 mg/mL時(shí)，凝膠儲(chǔ)能模量G'和損耗模量G''分別約為12 300 Pa和50 Pa。人血白蛋白和PEG-SS2混合5 min后，水凝膠模量在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)變化不大，表明反應(yīng)已經(jīng)充分。

2.4顯微結(jié)構(gòu)

水凝膠內(nèi)部存在多孔結(jié)構(gòu)。水凝膠的這種多孔結(jié)構(gòu)為水分子的進(jìn)出提供了路徑，允許水溶性物質(zhì)如養(yǎng)分、代謝物通過(guò)，有利于組織創(chuàng)面的修復(fù)與再生。

2.5體外降解

體外水解，水凝膠在6 d后降解比例超過(guò)60%，在12 d時(shí)僅殘余少量水凝膠。證明水凝膠具有良好的生物降解性。

2.6細(xì)胞毒性

培養(yǎng)24 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察L929細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果表明，水凝膠浸提液各試驗(yàn)組3細(xì)胞形態(tài)正常，貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞基本上呈梭性或不規(guī)則三角形，與正常細(xì)胞形態(tài)相似。與介質(zhì)對(duì)照組相比，試驗(yàn)組1的細(xì)胞存活率為98%，試驗(yàn)組2的細(xì)胞存活率為99%，試驗(yàn)組的細(xì)胞存活率為%%，試驗(yàn)組4的細(xì)胞存活率為96%。因此，在此次試驗(yàn)條件下，該外科手術(shù)封合劑100%試驗(yàn)液無(wú)潛在的細(xì)胞毒性［3］。

2.7脹破強(qiáng)度

脹破強(qiáng)度是外科手術(shù)封合劑重要指標(biāo)之一，脹破強(qiáng)度以及凝膠破壞方式可以反應(yīng)凝膠在組織表面的粘附性以及凝膠本體強(qiáng)度。Gonotti等在一項(xiàng)多中心的前瞻性隨機(jī)試驗(yàn)中研究了肺部手術(shù)切除后纖維蛋白膠封合能力，發(fā)現(xiàn)纖維蛋白膠能夠顯著降低肺部手術(shù)后氣體漏氣持續(xù)時(shí)間。Moser等在一項(xiàng)前瞻性的隨機(jī)試驗(yàn)中，研究了肺減容手術(shù)中使用纖維蛋白膠對(duì)于氣體漏氣時(shí)間和置管引流時(shí)間的影響［4］，發(fā)現(xiàn)使用纖維蛋白膠后持續(xù)漏氣時(shí)間和留置引流時(shí)間都顯著降低，22例使用纖維蛋白膠的病人僅1例發(fā)生術(shù)后持續(xù)性漏氣［5-10］，而22例對(duì)照組病人有7例發(fā)生術(shù)后持續(xù)性漏氣，胸腔置管引流時(shí)間分別為（2.83± 1.96）d和（5.88±2.96）d。白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝膠脹破強(qiáng)度為16.5 kPa，顯著高于纖維蛋白膠脹破強(qiáng)度（1.3 kPa）。

3　結(jié)語(yǔ)

基于聚乙二醇衍生物和人血白蛋白凝膠具有凝膠速度快、脹破強(qiáng)度高、組織粘附性好和細(xì)胞毒性低的特點(diǎn)，該水凝膠有望用于肺部手術(shù)后漏氣封合。

［1］周虹，王華光，劉麗宏，等.468例人血白蛋白臨床應(yīng)用調(diào)查與分析［J］.中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2014（5）：311-314，315.

［2］徐峰.人血白蛋白275例臨床應(yīng)用調(diào)查分析［J］.現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2013，25（3）：334-336.

［3］嚴(yán)汝慶.人血白蛋白臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2013，13（7）：902-905.

［4］韓一波，宣澤勝.人血白蛋白使用的臨床藥學(xué)干預(yù)［J］.醫(yī)學(xué)信息，2013（29）：447.

［5］朱素燕，徐萍，劉瑤，等.人血白蛋白臨床應(yīng)用1580例調(diào)查與分析［J］.中國(guó)藥物與臨床，2015（1）：22-25.

［6］王松.呼吸機(jī)膜材料的選擇及其生物相容性［J］.中國(guó)組織工程研究，2012，16（12）：2221-2224.

［7］李榮，王衡東，王文峰，等.聚丙烯無(wú)紡布親水性與血液相容性改性初步研究［J］.中國(guó)輸血雜志，2012，25（11）：1165-1169.

［8］石強(qiáng)，門小菲，趙杰，等.用于血液存儲(chǔ)與輸注的聚丙烯材料的制備［J］.中國(guó)輸血雜志，2011，24（11）：933-935.

［9］毛志剛，陳朝輝，韓宏光.人工血管材料生物相容性和血液相容性的研究與分析［J］.中國(guó)組織工程研究，2012，16 （16）：2981-2988.

［10］陳歐，邱雄，邵澤勇，等.血液透析膜生物相容性及在重癥胰腺炎中的應(yīng)用［J］.中國(guó)組織工程研究，2016，20（8）：1177-1182.

Preparation and Properties of a Kind of Human Albumin and Polyethylene Glycol Derivatives

LI Dan，WANG Wei，ZHU Wei-bin，LIN Gao-pin
Hangzhou City，Zhejiang Province，Ya Hui biological Science and Technology Co.，Ltd，Hangzhou，Zhejiang Province，310052 China

R313

A

2096-1782（2016）08-0005-03

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.08.005

李丹（1982.11-），浙江杭州人，博士，中級(jí)工程師，研究方向：生物醫(yī)用材料。

2016-06-05）