岳紅紅 趙 亮 姜 威

(武警總醫(yī)院1 過敏反應(yīng)科，2 醫(yī)務(wù)部，北京市 100039，E-mail：cctv201166@126.com)

論著·基礎(chǔ)研究

基于黏蛋白1的非小細(xì)胞肺癌基因疫苗的構(gòu)建及免疫原性評價

岳紅紅1趙 亮2姜 威2

(武警總醫(yī)院1 過敏反應(yīng)科，2 醫(yī)務(wù)部，北京市 100039，E-mail：cctv201166@126.com)

目的 構(gòu)建基于黏蛋白1(MUC1)的非小細(xì)胞肺癌基因疫苗，并對其免疫原性進(jìn)行評價。方法 利用弗林蛋白酶(furin)/2A序列將MUC1基因與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)基因進(jìn)行連接，克隆入真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建基因疫苗pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF。對基因疫苗進(jìn)行鑒定后將該疫苗體外轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)分別對MUC1、GM-CSF的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。將32只Balb/c小鼠分為空白對照組、空質(zhì)粒pVAX1組、pVAX1-MUC1組和pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組，每組8只。除空白對照組外，其余實(shí)驗(yàn)組每只小鼠肌肉注射相應(yīng)質(zhì)粒100 μg，并進(jìn)行電穿孔刺激，末次免疫后14 d采用ELISA和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法分別檢測其誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)果 成功克隆并構(gòu)建了非小細(xì)胞肺癌基因疫苗pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF，流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示MUC1在COS7細(xì)胞中的陽性表達(dá)率為10%，ELISA檢測結(jié)果顯示pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組GM-CSF表達(dá)水平高于空載體pVAX1組(P<0.05)。將疫苗免疫接種小鼠模型后，pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組誘導(dǎo)的MUC1抗體水平高于pVAX1-MUC1組(P<0.05)，pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組的小鼠脾細(xì)胞分泌干擾素-γ的斑點(diǎn)數(shù)多于pVAX1-MUC1組(P<0.05)。結(jié)論 pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF能夠同時誘導(dǎo)較高的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

非小細(xì)胞肺癌；基因疫苗；黏蛋白1；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；體液免疫；細(xì)胞免疫

非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的80%，惡性程度高，轉(zhuǎn)移早而廣泛，對化療、放療敏感，初治緩解率雖高，但極易發(fā)生繼發(fā)性耐藥，容易復(fù)發(fā)，其治療以全身化療為主?；熞詡鹘y(tǒng)化療藥物為主，包括依托泊苷、順鉑、環(huán)磷酰胺、阿霉素、伊立替康、紫杉醇、多西他賽等。研發(fā)其新型有效的治療方法和手段是目前的當(dāng)務(wù)之急?；蛞呙缱鳛橹鲃拥拿庖咧委煼绞?，由于其能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答而成為腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn)之一[1-2]。

在免疫治療中，靶抗原的選擇對治療的特異性和有效性具有重要的作用。黏蛋白1(mucin 1，MUC1)是一種跨膜糖蛋白，通常表達(dá)于乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的頂端表面[3]。而乳腺、前列腺、肺、結(jié)腸上皮腺癌表達(dá)異常形態(tài)的MUC1[1-2]。因此，靶向腫瘤表達(dá)的MUC1抗原的主動免疫治療可能有很大的治療價值。此外，一種編碼人類黏蛋白1(human mucin 1，hMUC1)的DNA疫苗已經(jīng)在高表達(dá)MUC1的上皮癌中進(jìn)行嘗試，其證明能夠有效抑制表達(dá)MUC1腫瘤的生長[4]。本研究將MUC1基因與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)基因構(gòu)建于同一個真核表達(dá)載體，并對其誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行初步評價。

1 材料和方法

1.1 基因疫苗的構(gòu)建和鑒定 將MUC1[GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)序列號：X80761.1]的胞外段編碼區(qū)和GM-CSF(GenBank序列號：M11220.1)的編碼區(qū)基因之間以弗林蛋白酶(furin)/2A序列進(jìn)行連接，構(gòu)成融合基因MUC1-F2A-GM-CSF，融合基因的上、下游分別引入酶切位點(diǎn)HindⅢ和 XboⅠ。融合基因在Invitrogen公司進(jìn)行全基因合成，然后將其克隆至基因疫苗常用真核表達(dá)載體pVAX1，獲得基因疫苗pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF。利用限制性內(nèi)切酶的酶切和基因測序?qū)蛞呙邕M(jìn)行鑒定，主要步驟：利用NEB公司的內(nèi)切酶HindⅢ(R0104V)和 XboⅠ(R0146V)，對獲得的基因疫苗pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF進(jìn)行酶切，能夠切下與目的基因MUC1-F2A-GM-CSF大小一致的條帶，即為構(gòu)建成功。

1.2 基因疫苗的真核表達(dá) 為了驗(yàn)證pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF的真核表達(dá)情況，利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司，貨號：11668019)將其轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞(購于中科院上海細(xì)胞庫)，以空載體pVAX1作為陰性對照，檢測GM-CSF表達(dá)時同時設(shè)立pVAX1-MUC1組，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和六孔板中的細(xì)胞進(jìn)行檢測，操作嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。轉(zhuǎn)染簡要步驟如下：轉(zhuǎn)染前1 d，將對數(shù)生長期的COS 7細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合度應(yīng)達(dá)到80%左右；利用無血清培養(yǎng)基分別配置轉(zhuǎn)染A液和B液，A液含有10 μl的轉(zhuǎn)染試劑，B液含有4 μg的轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒，A和B液在室溫下放置5 min后，將A液加入到B液中，此為C液，輕柔混勻，室溫放置20 min。將C液小心加入含有2 ml培養(yǎng)基和80%匯合度細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板中，輕柔混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育5 h。孵育結(jié)束后，用新鮮培養(yǎng)基洗滌6孔板中的細(xì)胞，最后加入2 ml新鮮的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行檢測。

由于MUC1是細(xì)胞膜表達(dá)，將收集的轉(zhuǎn)染細(xì)胞洗滌后，分別采用鼠源抗人MUC1抗體(Abcam公司，貨號：ab28081)和藻紅蛋白標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(Abcam公司，貨號：ab97024)為一抗和二抗，并分別孵育30 min后，上流式細(xì)胞儀(BD公司，型號：BD AccuriTMC6)檢測MUC1的陽性表達(dá)率(紅色熒光表示)。GM-CSF是分泌表達(dá)，所以將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清液包被于96孔微板中，采用鼠源的抗人GM-CSF單克隆抗體(Abcam公司，貨號：ab54429)作為一抗，二抗為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)公司，貨號：ZDR-5307)，顯色并終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀(美國伯樂公司，型號：Bio-Rad iMark)檢測波長在450 nm處的吸光度(A)值，樣品孔數(shù)值大于等于陰性孔數(shù)值2倍以上為陽性。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組和免疫接種 雌性Balb/c小鼠32只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)公司，4～6周齡，體重20～25 g，實(shí)驗(yàn)動物的喂養(yǎng)按照實(shí)驗(yàn)動物的護(hù)理和使用指南[5]。采用配對比較法隨機(jī)分組法將小鼠分為空白對照組、空質(zhì)粒pVAX1組，pVAX1-MUC1組和pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組，每組8只。除空白對照組外，其余實(shí)驗(yàn)組每只小鼠肌肉注射相應(yīng)質(zhì)粒100 μg，并進(jìn)行電穿孔刺激[6]，分別在一免后的第7天和第14天加強(qiáng)免疫，并進(jìn)行電穿孔刺激。末次免疫后的第14天，處死小鼠后內(nèi)進(jìn)行免疫原性檢測。

1.4 抗體滴度檢測和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測

1.4.1 抗體滴度檢測：末次免疫后14 d，小鼠眼眶取血約100 μl左右，室溫下自然沉淀2～3 h，然后1 500 r/min離心5 min，分離血清，檢測小鼠血清中的抗體滴度。將10 μg重組MUC1抗原(Abcam公司，貨號：ab80082)包被于96孔微板中，然后加入系列稀釋的各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清，孵育洗滌后，加入HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體，孵育洗滌后，3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺溶液顯色，反應(yīng)終止后，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處讀取數(shù)值。實(shí)驗(yàn)組A450的數(shù)值≥陰性對照2倍為陽性。

1.4.2 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme-linked immunospot assay，ELISpot)：末次免疫后14 d，無菌分離各個實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞，利用預(yù)先以抗干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)抗體包被的聚偏氟乙烯板，將分離的各組小鼠脾細(xì)胞分別加入到相應(yīng)的包被孔中。其中，加入MUC1蛋白作為刺激物的板孔為ELISpot檢測的實(shí)驗(yàn)組孔，不加刺激抗原的板孔稱為陰性對照孔；同時，還要設(shè)立陽性對照孔，即加入佛波酯的板孔。詳細(xì)操作過程參照ELISpot試劑盒(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，貨號：DKW22-2000-500)說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因疫苗的構(gòu)建和抗原表達(dá)檢測 基因疫苗構(gòu)建進(jìn)行測序鑒定正確；將其轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，孵育后流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，可以檢測到MUC1在COS7細(xì)胞中的表達(dá)，陽性表達(dá)率為10%，見圖1。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測結(jié)果顯示，pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組GM-CSF水平明顯高于空載體pVAX1組(P=44.57，P<0.001)，見表1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測重組質(zhì)粒中MUC1蛋白的表達(dá)

組別nA值pVAX1組30.02±0.03pVAX1-MUC1組31.07±0.21*pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組30.97±0.15*

注：與pVAX1組比較，*P<0.05。

2.2 ELISA檢測疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答 單獨(dú)抗原pVAX1-MUC1組和融合抗原pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組都能產(chǎn)生一定強(qiáng)度MUC1的抗體反應(yīng)，見圖2；但pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組誘導(dǎo)的MUC1抗體水平高于單獨(dú)抗原pVAX1-MUC1組(F=67.12，P<0.001)，見表2。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組抗體滴度比較

組別n抗MUC1抗體滴度水平pVAX1組424.4±16.7pVAX1-MUC1組42140.0±207.4*pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組43460.0±792.5*#

注：與pVAX1組比較，*P<0.05；與pVAX1-MUC1組比較，#P<0.05。

2.3 ELISPOT法檢測疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答 與對照組相比，無論是單獨(dú)抗原pVAX1-MUC1組還是融合抗原pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組免疫小鼠后的脾臟淋巴細(xì)胞，經(jīng)特異性抗原MUC1刺激后，均能產(chǎn)生IFN-γ分泌的斑點(diǎn)，見圖3。融合抗原疫苗pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組的小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ的斑點(diǎn)數(shù)多于單獨(dú)抗原pVAX1-MUC1組(F=85.13，P<0.001)，見表3。

圖3 具有代表性的各實(shí)驗(yàn)組ELISpot檢測斑點(diǎn)圖

組別n斑點(diǎn)數(shù)pVAX1組85.00±4.6pVAX1-MUC1組8152.0±45.0*pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組8232.0±41.0*#

注：與pVAX1組比較，*P<0.05；與pVAX1-MUC1組比較，#P<0.05。

3 討 論

當(dāng)前的免疫治療方法包括被動免疫和主動免疫兩大類：被動免疫常用方式就是單克隆抗體或者一些具有免疫活性的細(xì)胞因子等；而主動免疫就是疫苗類的制劑，諸如蛋白疫苗、樹突狀細(xì)胞疫苗以及基因疫苗等。雖然抗體免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)對于腫瘤的治療都具有相應(yīng)的作用，但是輔助性T細(xì)胞1(helper T cell 1，Th1)類細(xì)胞免疫反應(yīng)，特別是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反應(yīng)以及由此產(chǎn)生的一系列相關(guān)的細(xì)胞因子，如IFN-γ、腫瘤壞死因子-α及白細(xì)胞介素-2(interleukin，IL-2)[7]，可能是最終抑制和消除腫瘤的關(guān)鍵因素。因此理想的抗腫瘤疫苗必須既有能力誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，又有能力誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，特別是Th1和CTL反應(yīng)。

在眾多不同類型的疫苗中，基因疫苗由于能夠以模擬病毒感染的自然過程的方式進(jìn)行抗原遞呈，也就是主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ類分子遞呈途徑，因此其能夠誘導(dǎo)高效的細(xì)胞免疫反應(yīng)，特別是Th1類免疫應(yīng)答和 CTL反應(yīng)[8]。另外由于基因疫苗制備簡便，易于運(yùn)輸與儲存，成本低廉等優(yōu)勢，成為近年來腫瘤免疫和感染免疫方面研究的熱點(diǎn)[9]。多年來，由于基因疫苗的免疫原性較低，其研究和發(fā)展受到了一定的限制，曾經(jīng)一度出現(xiàn)停滯不前的現(xiàn)象。但是，自從在體電脈沖轉(zhuǎn)染這種高效的基因疫苗遞送方式用于基因疫苗的免疫接種后，其發(fā)展非常迅速[3]。當(dāng)然，提高基因疫苗效果的方法很多，將具有免疫刺激和調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子以分子內(nèi)佐劑的方式與腫瘤抗原融合是研究熱點(diǎn)之一。當(dāng)前研究最為成熟的免疫刺激分子之一是GM-CSF。它能夠刺激多種免疫細(xì)胞，例如DC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等發(fā)育和活化；它和IL-12及IL-2一樣，都是具有非常重要免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子；GM-CSF目前已經(jīng)發(fā)展成為蛋白藥物，臨床上用于腫瘤的輔助治療[10-11]。具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。此外，很多學(xué)者將其以輔助分子或者分子內(nèi)佐劑的方式加以應(yīng)用，這些都體現(xiàn)了其良好的抗腫瘤或者提高抑瘤效果的能力[12-13]。

近年來，肺癌的發(fā)病率在逐年提高，非小細(xì)胞肺癌更是難防難治，但其免疫治療手段卻取得了一些重要的突破性進(jìn)展。MUC1是當(dāng)前肺癌靶向治療中研究較多的一個靶抗原，以MUC1為靶點(diǎn)的肺癌疫苗已經(jīng)進(jìn)行到Ⅲ期臨床試驗(yàn)，且取得了較為理想的效果，因此，MUC1被看做是肺癌免疫治療的潛在理想靶抗原之一[14-15]。

本研究將具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的分子GM-CSF與非小細(xì)胞肺癌高表達(dá)抗原MUC1進(jìn)行融合，經(jīng)抗原表達(dá)檢測，可以檢測到MUC1在COS7細(xì)胞中的表達(dá)，且GM-CSF表達(dá)水平檢測結(jié)果顯示，pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組A值明顯高于空載體pVAX1組(P<0.05)，提示GM-CSF在COS7細(xì)胞內(nèi)能夠有效分泌表達(dá)，成功構(gòu)建了肺癌基因疫苗。將疫苗免疫接種小鼠模型后，ELISA檢測結(jié)果顯示，pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組誘導(dǎo)的抗體水平高于單獨(dú)抗原pVAX1-MUC1組(P<0.05)，提示將MUC1抗原與GM-CSF融合表達(dá)，能夠顯著提高M(jìn)UC1誘導(dǎo)的特異性抗體的產(chǎn)生，增強(qiáng)了體液免疫反應(yīng)；此外，融合抗原疫苗pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組的小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ的斑點(diǎn)數(shù)多于單獨(dú)抗原pVAX1-MUC1組(P<0.05)，提示與單獨(dú)抗原pVAX1-MUC1組相比，pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，說明GM-CSF作為分子內(nèi)佐劑，能夠顯著提高抗原誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的能力。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將深入研究該疫苗抑制腫瘤的效果，同時將利用其他肺癌靶抗原和成熟的佐劑分子，進(jìn)一步提高優(yōu)化和改善疫苗的效果，以期獲得一個良好的非小細(xì)胞肺癌基因疫苗候選品種。

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Construction and immunogenicity evaluation of non-small cell lung cancer gene vaccine based on mucin 1

YUEHong-hong1,ZHAOLiang2,JIANGWei2

(1DepartmentofAllergicReaction,2DepartmentofMedicalAffairs,GeneralHospitalofArmedPoliceForces,Beijing100039,China)

Objective To construct the non-small cell lung cancer gene vaccine based on mucin 1(MUC1),and to evaluate its immunogenicity.Methods MUC1 gene was fused with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF) by furin/2A sequence,and the fused gene was cloned into pVAX1 to construct the gene vaccine pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF.The gene vaccine was transfected into COS7 cells after identification,and then the expressions of MUC1 and GM-CS were detected by flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) respectively.Thirty-two Balb/c mice were divided into blank control group,pVAX1 group,pVAX1-MUC1 group and pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF group,with 8 mice in each group.Except the blank control group,the corresponding plasmids(100 μg) were injected into the mice of the experimental groups and electroporation stimulation was also performed in each mice.After 14 days of last immunization,the induced humoral immune and cellular immune responses were detected by ELISA and enzyme-linked immunospot assay respectively.Results Non-small cell lung cancer gene vaccine pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF was successfully cloned and constructed.The result of flow cytometry detection showed that MUC1 expressed in COS7 cell and the positive expression rate was 10%.And the result of ELISA showed that the GM-CSF expression level of pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF group was higher than that of pVAX1 group(P<0.05).After the mice models injected with the vaccine,the expression of MUC1 antigen induced by pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF group was higher than that induced by pVAX1-MUC1 group(P<0.05),and the spots of interferon-γ secreted by mice splenocytes in the pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF group was more than that in the pVAX1-MUC1 group(P<0.05).Conclusion The pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF can induce either high humoral immune response or cellular immune response. 【Key words】 Non-small cell lung cancer,Gene vaccine,Mucin 1,Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,Humoral immunity,Cellular immunity

岳紅紅(1975～)，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：過敏反應(yīng)學(xué)。

姜威(1972～)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：呼吸內(nèi)科危重癥救治及肺癌的相關(guān)基礎(chǔ)研究，E-mail：wuweiwenzhang07@sohu.com。

R 392.11

A

0253-4304(2016)09-1197-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.03

2016-05-09

2016-06-29)