魏斐斐 廖 燕 趙瑞強(qiáng) 王洪學(xué) 謝裕安

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部，南寧市 530021，E-mail：weifeifei20071@163.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，南寧市 530021)

論著·基礎(chǔ)研究

壯族家系Krüppel樣因子6基因多態(tài)性與肝癌易感性的關(guān)系▲

魏斐斐1廖 燕1趙瑞強(qiáng)2王洪學(xué)1謝裕安1

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部，南寧市 530021，E-mail：weifeifei20071@163.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，南寧市 530021)

目的 探討Krüppel樣因子6(KLF6)基因rs7634位點(diǎn)多態(tài)性與壯族人群肝細(xì)胞癌(HCC)易感性的關(guān)系。方法 選取廣西扶綏縣壯族人群10個(gè)正常對(duì)照家系(40例)及20個(gè)肝癌家系(79例)，后者包括HCC患者20例及其未患HCC的直系親屬59例。運(yùn)用質(zhì)譜方法檢測(cè)KLF6基因rs7634位點(diǎn)基因型及等位基因的分布頻率；應(yīng)用非條件logistic回歸分析不同基因型及等位基因與HCC發(fā)病的關(guān)系。結(jié)果 在肝癌患者、肝癌家系親屬和正常家系人群中，KLF6基因rs7634位點(diǎn)TT基因型的分布頻率分別為40.00%、54.24%和87.50%，TA基因型的分布頻率分別為60.00%、42.37%和12.50%，AA基因型的分布頻率分別為0、3.39%和0，T等位基因的分布頻率分別為70.00%、75.42%和93.75%，A等位基因的分布頻率分別為30.00%、24.58%和6.25%。在肝癌患者及正常家系人群中，攜帶TA基因型個(gè)體發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型個(gè)體的10.5倍(P<0.05)，攜帶A等位基因個(gè)體發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是T基因型個(gè)體的6.429倍(P<0.05)；在肝癌患者及肝癌家系直系親屬中，攜帶TA基因型個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型個(gè)體的1.667倍，攜帶A基因型個(gè)體發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是T基因型個(gè)體的1.257倍，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 KLF6基因rs7634多態(tài)性與壯族家系肝癌易感性關(guān)系密切，攜帶TA基因型或A等位基因可能是HCC發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

肝細(xì)胞癌；Krüppel 樣因子6；單核苷酸多態(tài)性；家系；易感；壯族；廣西；扶綏縣

肝癌是世界上最常見(jiàn)和惡性程度最高的腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年世界范圍內(nèi)有782 500新增肝癌病例和745 500死亡病例，中國(guó)的新增病例和死亡病例約占了50%[1]。除了環(huán)境等外在綜合致癌因素外，肝癌的發(fā)生和發(fā)展很大程度上與個(gè)體間基因型的遺傳多態(tài)性密切相關(guān)。有研究結(jié)果顯示肝癌存在明顯的家族聚集傾向，這提示遺傳因素在肝癌發(fā)病中具有重要作用[2]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為第3代遺傳標(biāo)記，反映了個(gè)體間的遺傳差異，是研究肝癌遺傳易感性的重要物質(zhì)。Krüppel樣因子6(Krüppel-like factor 6，KLF6)為Krupple樣家族成員之一，是最新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其參與細(xì)胞的分化、發(fā)育、生長(zhǎng)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、凋亡和血管形成等過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，KLF6基因的缺失、突變與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。目前關(guān)于KLF6基因突變?cè)诟伟┲械淖饔玫难芯拷Y(jié)果尚不一致[4-6]。本研究采用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)廣西扶綏縣肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)家系與正常對(duì)照家系的KLF6基因rs7634位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)與分型，以探討KLF6基因多態(tài)性與HCC遺傳易感性的關(guān)系，從而為HCC的發(fā)病機(jī)制、診斷、及預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 10個(gè)正常家系及20個(gè)肝癌家系均來(lái)自肝癌高發(fā)地區(qū)廣西扶綏縣壯族人群。肝癌患者均經(jīng)病理組織學(xué)診斷為HCC，于2003年1月至2011年10月期間在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)，術(shù)前均未行放射、化學(xué)或生物治療。20個(gè)肝癌家系由肝癌患者20例及其直系親屬59例組成，共79例，其中經(jīng)病史采集確認(rèn)肝癌患者的直系親屬中至少有1人確診為HCC，而納入直系親屬是指與肝癌患者有直接血緣關(guān)系的未患肝癌的親屬，包括一級(jí)親屬(父母、子女、兄弟姐妹)和二級(jí)親屬(叔伯、堂兄弟、堂姐妹)。79例肝癌家系中，男45例，女34例，年齡16～86歲，中位年齡44歲；HbsAg(+) 50例，HbsAg(-)29例；甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)(+)14例，AFP(-)65例； 吸煙(≥10支/d )17例，不吸煙(<10支/d)60例，其余2例信息缺失；飲酒(≥100 g/d)64例，不飲酒(<100 g/d)12例，其余3例信息缺失。10個(gè)正常家系由在扶綏縣醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的人群組成，與肝癌家系組無(wú)血緣關(guān)系，體檢結(jié)果均健康，無(wú)肝炎病史、腫瘤病史及遺傳病史，共40例，其中男26例，女14例，年齡16～85歲，中位年齡47歲；吸煙(≥10支/d)15例，不吸煙(<10支/d)25例，飲酒(≥100 g/d)17 例，不飲酒(<100 g/d)23例。正常對(duì)照家系與肝癌家系間年齡、性別、吸煙史等基本資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究按照國(guó)家人類基因組研究倫理準(zhǔn)則進(jìn)行，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器：血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒購(gòu)于北京天根生物科技有限公司，iPLEX反應(yīng)試劑、384-well SpectroCHIP生物芯片、質(zhì)譜檢測(cè)儀及點(diǎn)樣儀均購(gòu)自美國(guó)Sequenom公司，Hotstart Taq酶購(gòu)自美國(guó)Agena Bioscience公司，384孔雙頭PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物購(gòu)自深圳華大基因公司。

1.2.2 DNA提取及KLF6基因檢測(cè)：采用血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒，對(duì)20例肝癌患者手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本、59例肝癌家系直系親屬及40例正常對(duì)照家系靜脈血液標(biāo)本提取DNA，提取的DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，所有操作?yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。所提取的DNA用于分析KLF6基因型的基因組DNA：先通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加入SNP序列特異延伸引物，在SNP位點(diǎn)上，延伸 1個(gè)堿基。將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管，將樣品轉(zhuǎn)移到SpectroCHIP芯片后，即可放入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)只需 3～5 s，全自動(dòng)分析。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及合成： 應(yīng)用Assay Designer 3.1 Software(美國(guó)Sequenom公司)設(shè)計(jì)引物，由深圳華大基因公司合成引物。與任何一個(gè)SNP位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的是一條延伸引物和兩條PCR擴(kuò)增引物。擴(kuò)增引物1-上游 5′-ACGTTGGATGGTGGTCATCTCATCTCATGG-3′；擴(kuò)增引物1-下游 5′-ACGTTGGATGCCTTGTGGTTAGCAAGACTG-3′；延伸引物序列5′-TCTCATCTCATGGTATACTCCTT-3′。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及芯片點(diǎn)樣： 首先使用Hotstart Taq酶，在384孔板上常規(guī)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)以擴(kuò)增待測(cè)片段，然后將2 μl蝦堿性酸化酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP；Sequenom公司)消化液(雙蒸水1.53 μl，HME緩沖液0.17 μl，SAP 0.474 U)加入到PCR產(chǎn)物中，消化反應(yīng)37℃ 60 min、85℃ 10 min，以除去未用盡三磷酸脫氧核苷。 然后根據(jù)Sequenom程序進(jìn)行引物單堿基延伸反應(yīng)和延伸產(chǎn)物樹脂除鹽純化反應(yīng)。最后將檢測(cè)樣品從384孔反應(yīng)板轉(zhuǎn)移到表面覆蓋基質(zhì)的MassARRAY SpectroCHIP芯片[7]。

1.2.5 飛行質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)：采用Mass ARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)(美國(guó)Sequenom公司)進(jìn)行KLF6的SNP基因分型；實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分型數(shù)據(jù)采用TYPER4.0軟件分析，均由Sequenom實(shí)驗(yàn)平臺(tái)(深圳華大基因公司)支持。SNP分型是根據(jù)引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物質(zhì)譜峰的位置確定其分子質(zhì)量，從而得出SNP分型結(jié)果。同一種顏色可以對(duì)應(yīng)2個(gè)或3個(gè)峰值，分別為SNP位點(diǎn)的延伸引物峰及兩個(gè)等位基因峰，若該位點(diǎn)屬于純合子，則僅存在1個(gè)等位基因峰，若為雜合子，則存在2個(gè)等位基因峰[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析各組基因型分布的Hardy-Weinberg遺傳平衡，以判斷所調(diào)查對(duì)象是否具有人群代表性。采用非條件logistic回歸分析法計(jì)算不同等位基因及基因型與HCC發(fā)病的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因型檢測(cè)結(jié)果 KLF6基因rs7634位點(diǎn)存在TT、TA、AA3種基因型。119例樣本中，TT基因型75例、TA基因型42例、AA基因型2例。見(jiàn)圖1。

A rs7634基因型TT

B rs7634基因型TA

C rs7634基因型AA

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 在正常對(duì)照家系及肝癌家系中，TT、TA、AA基因型頻率觀察值與期望值之間吻合度均較好(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，提示各組均具有人群代表性。見(jiàn)表1。

表1 KLF6基因rs7634位點(diǎn) 基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

2.3 KLF6基因rs7634位點(diǎn)多態(tài)性與HCC發(fā)病的關(guān)系 KLF6基因rs7634位點(diǎn)TT基因型在肝癌患者、肝癌家系親屬和正常家系人群中的分布頻率分別為40.00%(8/20)、54.24%(32/59)和87.50%(35/40)；TA基因型在肝癌患者、肝癌家系和健康對(duì)照家系中的分布頻率分別為60.00%(12/20)、42.37%(25/59)和12.50%(5/40)；AA基因型在肝癌患者、肝癌家系和健康對(duì)照家系中的分布頻率分別為0(0/20)、3.39%(32/59)和0(0/40)。非條件logistic回歸分析結(jié)果顯示，在肝癌患者及正常家系人群中，攜帶TA基因型個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型個(gè)體的10.5倍(P<0.05)，見(jiàn)表2；在肝癌患者及肝癌家系直系親屬中，攜帶TA基因型個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型個(gè)體的1.667倍，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。KLF6基因rs7634位點(diǎn)T等位基因在肝癌患者、肝癌家系親屬和正常家系人群中的分布頻率分別為70.00%(28/40)、75.42%(89/118)和93.75%(75/80)；KLF6基因rs7634位點(diǎn)A等位基因在肝癌患者、肝癌家系親屬和正常家系人群中的分布頻率分別為30.00%(12/40)、24.58%(29/118)和6.25%(5/80)。非條件logistic回歸分析結(jié)果顯示，在肝癌患者及正常家系人群中，攜帶A等位基因個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)是T基因型個(gè)體的6.429倍(P<0.05)，見(jiàn)表2；在肝癌患者及肝癌家系直系親屬中，攜帶A基因型個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)是T基因型個(gè)體的1.257倍，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表2 肝癌患者及正常家系中rs7634位點(diǎn)多態(tài)性與HCC發(fā)病的關(guān)系(n，%)

表3 肝癌患者及其親屬中rs7634位點(diǎn)多態(tài)性與HCC發(fā)病的關(guān)系(n，%)

3 討 論

肝癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤。流行病學(xué)研究結(jié)果已表明，肝癌發(fā)生的高危因素包括HBV/HCV 感染、黃曲霉毒素B1暴露、飲用水污染等[2]，但是亦有研究表明在相同的致癌因素作用下，只有少部分個(gè)體罹患肝癌，提示個(gè)體差異的遺傳易感性對(duì)于肝癌的發(fā)生具有重要作用[2]。研究表明SNP在人群中發(fā)生頻率>1%，與疾病易感性的改變密切相關(guān)[8]。KLF6屬于Krupple樣家族成員，定位于人類染色體10p15，全長(zhǎng)約7 kb，表達(dá)產(chǎn)物是含283個(gè)氨基酸的蛋白，在大多數(shù)組織、器官中均有表達(dá)，是一種廣泛表達(dá)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。KLF6作為一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，參與了細(xì)胞的分化、發(fā)育、生長(zhǎng)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、凋亡和血管形成等過(guò)程。KLF6基因含4個(gè)外顯子，第2、3外顯子通常發(fā)生突變?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，KLF6基因的缺失、突變與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在前列腺癌[9]、肺癌[10]、結(jié)腸癌[11]、卵巢癌[12]、胃癌[13]、惡性黑色素瘤[14]及乳腺癌[15]患者中有KLF6基因不同程度的突變和缺失。

近年來(lái)對(duì)KLF6在肝癌中的研究多集中在KLF6是否發(fā)生突變的問(wèn)題上，而所得研究結(jié)論不盡相同。Wang等[6]發(fā)現(xiàn)在所檢測(cè)的HCC組織中，49%～52%存在KLF6基因異常，包括突變或雜合性缺失。而Song等[5]檢測(cè)79例HCC患者的KLF6基因后發(fā)現(xiàn)，在癌組織中未見(jiàn)KLF6的突變基因；Boyault等[4]也報(bào)告KLF6的突變可能在HCC發(fā)生中的作用較小。單個(gè)堿基突變或SNP會(huì)導(dǎo)致基因異常剪接，選擇性剪接可導(dǎo)致KLF6產(chǎn)生剪接變異體，如KLF-SV1、KLF-SV2和KLF-SV3[6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在肝癌中KLF-SV1 mRNA表達(dá)升高并拮抗野生型KLF6的作用[16]；KLF-SV2在肝癌中表達(dá)下降，并出現(xiàn)抗增殖和促凋亡的作用[17]。研究表明，KLF6基因多態(tài)性與腫瘤關(guān)系密切[18-20]。KLF6基因內(nèi)含子1(IVS1-27G>A；rs3750861)SNP可增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，如：前列腺癌[18]、肺癌[19]。而Chen等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)人群中KLF6 IVS1-27的AA基因型與降低胃癌的風(fēng)險(xiǎn)和胃癌分期相關(guān)。

本研究應(yīng)用飛行質(zhì)譜技術(shù)的方法分析了廣西扶綏地區(qū)79例肝癌家系和40例正常對(duì)照家系人群KLF6基因rs7634位點(diǎn)多態(tài)性，結(jié)果顯示，在肝癌患者及正常家系人群中，攜帶TA基因型個(gè)體發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型個(gè)體的10.5倍(P<0.05)，攜帶A等位基因個(gè)體發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是T基因型個(gè)體的6.429倍(P<0.05)。這提示KLF6基因rs7634位點(diǎn)多態(tài)性與發(fā)生HCC有關(guān)，攜帶A等位基因及TA基因型是肝癌的危險(xiǎn)因素，這與其他學(xué)者[18-19]提出的KLF6單核苷酸多態(tài)性可增加腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)論相符。

綜上所述，KLF6基因rs7634位點(diǎn)多態(tài)性與發(fā)生HCC有關(guān)，攜帶A等位基因及TA基因型是肝癌易感性的危險(xiǎn)因素。但本次研究收集病例數(shù)有限，同時(shí)研究局限于廣西扶綏縣的壯族人群，故結(jié)論仍需擴(kuò)大樣本例數(shù)、在不同地域及人群中進(jìn)行研究以進(jìn)一步證實(shí)。

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Relationship of Krüppel-like factor 6 gene polymorphism with susceptibility to hepatocellular carcinoma in family of Zhuang nationality

WEIFei-fei1,LIAOYan1,ZHAORui-qiang2,WANGHong-xue1,XIEYu-an1

(1DepartmentofExperimentalResearch,AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the relationship between polymorphism of Krüppel-like factor 6 (KLF6) gene locus rs7634 and the susceptibility to hepatocellular carcinoma(HCC) in family of Zhuang nationality.Methods Ten normal control families(n=40) and 20 HCC families(n=79) including 20 patients with HCC and their 59 lineal consanguinity without HCC were enrolled.All subjects were Zhuang nationality from Fusui County of Guangxi.The distribution frequencies of genotypes and alleles of KLF6 gene locus rs7634 were determined using mass spectrometry method.The relationship of different genotypes and alleles with incidence of HCC was analyzed using unconditional logistic regression model.Results Among the patients with HCC,lineal consanguinity of HCC families and persons from normal families,the frequencies of genotype TT of KLF6 gene locus rs7634 were 40.00%,54.24% and 87.50% respectively,the frequencies of genotype TA were 60.00%,42.37% and 12.50% respectively,the frequencies of genotype AA were 0,3.39% and 0 respectively,the frequencies of allele T were 70.00%,75.42% and 93.75% respectively,and the frequencies of allele A were 30.00%,24.58% and 6.25% respectively.In the patients with HCC and persons from normal family,the risk for HCC of the individuals with genotype TA was 10.5 times the risk of the individuals with genotype TT(P<0.05),and the risk for HCC of the individuals with allele A was 6.429 times the risk of the individuals with allele T(P<0.05).In the patients with HCC and lineal consanguinity of HCC families,the risk for HCC of the individuals with genotype TA was 1.667 times the risk of the individuals with genotype TT,and the risk for HCC of the individuals with allele A was 1.257 times the risk of the individuals with allele T,but no statistical differences were observed(P>0.05).Conclusion The polymorphism of KLF6 gene locus rs7634 closely correlates with susceptibility to HCC in family of Zhuang nationality.Carrying genotye TA or allele T might be the risk factors for HCC. 【Key words】 Hepatocellular carcinoma,Krüppel-like factor 6,Single nucleotide polymorphism,Family clustering,Susceptibility,Zhuang nationality,Guangxi,Fusui County

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260320)

魏斐斐(1987～)，女，在讀博士研究生，研究方向：腫瘤基礎(chǔ)及臨床研究。

謝裕安(1964～)，男，博士，教授，研究方向：腫瘤免疫與基因治療研究，E-mail：gxxya@aliyun.com。

R 735.7

A

0253-4304(2016)11-1481-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.11.01

2016-05-14

2016-08-04)