王立振，楊　敏

(江蘇省原子醫(yī)學研究所，衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗室，江蘇省分子核醫(yī)學重點實驗室，江蘇 無錫　214063)

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89Zr標記放射性藥物應用進展

王立振，楊敏

(江蘇省原子醫(yī)學研究所，衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗室，江蘇省分子核醫(yī)學重點實驗室，江蘇 無錫214063)

摘要：正電子發(fā)射計算機斷層顯像(PET)具有靈敏度高、可定量等優(yōu)點，是當前發(fā)展迅速的分子顯像技術(shù)。89Zr是一種新型正電子顯像核素，半衰期及能量適中，適于大分子生物活性物質(zhì)的標記及臨床應用。本文對89Zr的生產(chǎn)、標記方法以及89Zr標記化合物的研究進展進行綜述。

關(guān)鍵詞：鋯-89；PET；放射性藥物；標記

“免疫顯像”是最有前景的分子影像技術(shù)，利用放射性核素標記的抗體與抗原結(jié)合，通過正電子發(fā)射計算機斷層顯像(positron emission computed tomography，PET)反映活體狀態(tài)下分子水平變化，并進行定性和定量研究。與經(jīng)典的醫(yī)學影像技術(shù)相比，具有“看得早”的特點，可在尚無解剖改變的疾病前檢出異常。免疫顯像在探索疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，評價藥物的療效中發(fā)揮了連接分子生物學與臨床醫(yī)學的橋梁作用[1-2]。

分子探針是進行分子顯像的先決條件，18F是常用的放射性核素，具有良好的分子顯像性能，但其半衰期較短(t1/2=109 min)。大分子生物活性物質(zhì)如抗體等在靶組織中滯留時間長，需要長半衰期的核素以滿足顯像的需求[3]。89Zr是新型正電子核素，半衰期78.4 h，平均正電子能量0.389 MeV，物理半衰期與單抗或單抗片段的生物半衰期相匹配，是PET免疫顯像的理想核素。89Zr標記適用于肽段、肽段聚合物、納米粒子、微球、靶向的納米管、脂質(zhì)體和蛋白的體內(nèi)PET研究，迄今為止89Zr標記的主要載體仍是抗體[4-6]。本文擬對89Zr的生產(chǎn)、標記方法以及89Zr標記化合物的應用研究進行介紹。

189Zr的生產(chǎn)

1986年，Link 等[7]用13 MeV光子撞擊89Y，通過(p,n)核反應首次生產(chǎn)出89Zr，經(jīng)過純化，產(chǎn)率為80%，放射性核素純度超過99%。目前，低能量的回旋加速器均能生產(chǎn)純度達99.99%的放射性核素89Zr[8-9]。89Zr通常以草酸鋯[89Zr]或氯化鋯[89Zr]溶液形式存在。為了適應臨床需要，滿足藥物生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的自動化89Zr合成系統(tǒng)已經(jīng)建立。例如 Wooten等[10]報道安全常規(guī)生產(chǎn)89Zr的定制系統(tǒng)，基于先前分離和純化技術(shù)的發(fā)展可獲得高純度放射性核素(>99.99%)和令人滿意的比活度1.85×1014～1.31×1016Bq/mol。

289Zr的標記方法

2.1直接標記法

雖然不含螯合劑的直接標記法已被用于脂質(zhì)體和血清蛋白的89Zr標記[11-12]，但89Zr4+非常容易從靶向載體上脫離，釋放的89Zr4+能結(jié)合血漿蛋白并在骨聚集[13-14]。多數(shù)情況下，只有金屬核素對蛋白質(zhì)具有很強的親和性或能與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合時才能直接標記89Zr，但標記物穩(wěn)定性差，放射性核素易從體內(nèi)被清除，從而降低對比度，影響圖像質(zhì)量。

2.2間接標記法

目前，89Zr的標記主要為間接標記法，即89Zr與預先連接在載體上的雙功能螯合基團生成配合物從而完成標記。常用的螯合劑有二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，乙二胺四乙酸(EDTA)，1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)，去鐵胺(DFO)等[15-17]。

DFO是最常見的89Zr4+標記螯合劑，包含三個異羥肟酸基團用于螯合金屬和一個用于偶聯(lián)生物分子的伯胺基。DFO是一種六配基鐵螯合劑，可與金屬生成穩(wěn)定的絡合物，例如其與游離的鐵蛋白和含鐵血黃素的Fe3+形成穩(wěn)定的鐵胺復合物。研究顯示89Zr-DFO具有良好的穩(wěn)定性，在血清中孵育24 h后，89Zr4+釋放低于0.2%，并且7 d后血清中游離出來的89Zr4+仍少于2%[18-19]。采用DFO進行標記，首先采用Na2CO3或HEPES緩沖液將草酸鋯[89Zr]溶液的pH調(diào)整至7，加入含DFO的生物活性物質(zhì)，室溫下反應30～60 min，最后經(jīng)HPLC、排阻色譜等獲得純化產(chǎn)物，產(chǎn)率為35%～98%。

389Zr標記藥物的應用

單克隆抗體(MAb)是針對專一的抗原決定簇產(chǎn)生的抗體，生物活性單一，與抗原特異性結(jié)合，可直接用于人類疾病的診斷、預防、治療以及免疫機制的研究，為人類惡性腫瘤的免疫診斷與治療開辟了廣闊前景[20]。

自89Zr首次應用于PET顯像以來，相繼進行了多項89Zr標記單抗的臨床前研究，包括嵌合型單抗U36、DN30(抗cMet)、G250、西妥昔單抗、替伊莫單抗、利妥昔單抗、貝伐珠單抗和曲妥珠單抗等[21-24]。上述89Zr標記的抗體均顯示出良好的臨床轉(zhuǎn)化前景。

3.189Zr-CD20抗體

CD20是相對分子質(zhì)量為33～37 kD的磷酸化蛋白分子，有279個氨基酸殘基，以非糖基化形式存在，是B淋巴細胞表面分化抗原，主要參與調(diào)節(jié)B淋巴細胞的增殖與分化，在免疫系統(tǒng)中起重要作用,CD20在B細胞性淋巴瘤、多發(fā)白血病、慢性B淋巴白血病細胞和黑色素瘤細胞的表面表達，是免疫學治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)的理想靶點。CD20非游離態(tài)蛋白質(zhì)，不阻斷抗體與B淋巴細胞的結(jié)合。在淋巴瘤的治療中，應用CD20單克隆抗體(利妥昔單抗)治療是目前最重要的一種手段[25-26]。

89Zr標記的CD20抗體可用于非霍奇金淋巴瘤(NHL)療效的檢測。89Zr絡合DFO標記的利妥昔單抗，能與表達在轉(zhuǎn)基因小鼠(huCD20TM)上的人細胞分化抗原CD20特異性結(jié)合。89Zr-替伊莫單抗(Ibritumomab)可用于評估靶向治療藥90Y-Ibritumomab的生物分布和輻射劑量。復發(fā)或難治性侵襲性B細胞(CD20-陽性)非霍奇金淋巴瘤(NHL)的患者注射70 MBq89Zr-Ibritumomab后行PET掃描，2周后以15 MBq/kg或30 MBq/kg再次注射90Y-Ibritumomab，結(jié)果顯示90Y-Ibritumomab治療并不影響89Zr-Ibritumomab生物分布。最高90Y的肝吸收劑量為(3.2±1.8) mGy/MBq，脾為(2.9±0.7) mGy/MBq。這表明，89Zr-Ibritumomab PET掃描能夠用于評估、預測和定量分析90Y-Ibritumomab的生物分布，優(yōu)化病人治療劑量[27-29]。

3.289Zr-CD44抗體

細胞表面糖蛋白CD44與許多生物活動過程相關(guān)，包括淋巴細胞與內(nèi)皮細胞之間的相互作用、物質(zhì)的轉(zhuǎn)移過程、細胞的遷移和T細胞的活化或粘附。CD44存在兩種類型，CD44S(標準型)和CD44V(變異型)，標準型主要在生理狀態(tài)下表達，變異型主要在病理狀態(tài)下表達[30-31]。CD44的V6剪接體與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，且易于表達在鱗狀細胞癌上。CD44V6低表達的大腸癌患者生存率高于CD44V6高表達者，提示CD44V6是一個預后不良的指標[32]。

臨床前研究表明，89Zr標記的抗CD44V6嵌合單克隆抗體(89Zr-cU36)能夠檢測頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)移植瘤。此外，89Zr-cU36 PET顯像是一種適合用于檢測90Y-cU36治療劑量的有效方法[33-34]。臨床試驗表明，該示蹤劑能夠在頭頸部區(qū)域檢測原發(fā)腫瘤以及轉(zhuǎn)移灶，具有和計算機斷層掃描(CT)及磁共振成像(MRI)相似的靈敏度[35]，89Zr-cU36對伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸部鱗狀細胞癌(HNScC)具有診斷價值，20例計劃手術(shù)切除原發(fā)腫瘤及單側(cè)或雙側(cè)頸淋巴清掃的患者于術(shù)前進行CT和/或MRI檢查及89Zr-cU36免疫PET，結(jié)果免疫PET檢出全部原發(fā)腫瘤(n=17)以及25枚陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的18枚，而遺漏的淋巴結(jié)相對較小且腫瘤組織含量極少。89Zr-cU36 PET顯像不能有效區(qū)分微小轉(zhuǎn)移灶，不適合臨床分期，所以89Zr-cU36 PET顯像可能更適宜于表征腫瘤。此外，89Zr-cU36 的平均有效輻照劑量為0.53～0.66 mSv/MBq，明顯高于臨床使用的平均有效輻照劑量，限制了89Zr-cU36 PET的應用[36]。同時，20名患者中僅有2名產(chǎn)生了嵌合體cU36抗體(HACA)，可能影響重復成像過程。

89Zr-RG7356能夠?qū)闪?MDA-MB-231、PL45等)鼠模型的CD44+進行選擇性的反應性或非反應性地結(jié)合。健康短尾猴全身PET顯像[37]發(fā)現(xiàn)，89Zr-RG7356在脾臟、唾液腺和骨髓中有攝取，表明CD44在這些器官也有表達。89Zr-RG7356在正常器官的攝取隨著非標記的RG7356的用量增加而攝取顯著減少，表明CD44是可飽和的靶點。

3.389Zr-EGFR抗體

表皮生長因子(EGFR)是原癌基因中的一種，屬于I型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，EGFR的核內(nèi)信號通路屬于非經(jīng)典的信號傳導通路，此通路啟動后，可以使細胞周期的進程加速，在許多腫瘤例如乳腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌的識別、增殖和存活中發(fā)揮著重要的作用[38]。EGFR的過度表達與高度侵襲性和預后不良密切相關(guān)，許多抗體被開發(fā)用于抑制EGFR的激活。西妥昔單抗是一個IgG嵌合體，能與配體結(jié)合區(qū)域結(jié)合而誘導EGFR的內(nèi)化作用并因此阻斷后續(xù)反應的信號系統(tǒng)[39]。研究表明[40]，一些腫瘤在西妥昔單抗的治療下而變小或好轉(zhuǎn)。但89Zr-西妥昔單抗與90Y或177Lu標記的西妥昔單抗相比其骨攝取較高，表明89Zr易于與骨結(jié)合?？紤]到89Zr的骨攝取，評估骨攝取劑量不準確。89Zr-西妥昔單抗的攝取與EGFR在體內(nèi)的表達有關(guān)[41]。

帕尼單抗是第一個被FDA批準用于治療有EGFR表達轉(zhuǎn)移型結(jié)腸直腸癌(mCRC)的人類重組單克隆抗體(IgG2)[42]。在一些用帕尼單抗的非侵襲性研究中，報道了腫瘤表達HER1的體內(nèi)顯像研究[43]。最近,用89Zr-帕尼單抗與111In-帕尼單抗對HER1進行PET顯像的對比評估，發(fā)現(xiàn)89Zr-帕尼單抗與111In-帕尼單抗在組織器官中的生物分布幾乎相同[44]。而且，89Zr-帕尼單抗的靶向結(jié)合與HER1的表達相關(guān)。

3.4靶向 HER2

人類表皮生長因子2(HER2)是原癌基因家族的另一成員，它與表皮生長因子受體家族的其他成員一起參與腫瘤的血管生成、識別、轉(zhuǎn)移、增殖以及細胞存活間的異源二聚體化[45]。HER2在腫瘤如乳腺癌、卵巢癌等中過度表達。FDA批準抗體曲妥珠單抗用于HER2陽性表達乳腺癌的治療，有效性取決于HER2的表達水平[46]。HER2在腫瘤中的表達水平并非恒定并且隨著時間的改變而變化。此外，HER2在原發(fā)病灶和遠處轉(zhuǎn)移病灶中的表達也不盡相同。放射性核素標記的曲妥珠單抗已用于體內(nèi)非侵襲性HER2顯像[47-49]。89Zr-曲妥珠單抗在HER2陽性表達的腫瘤中高度特異性攝取，而18F-FDG和18F-FLT卻不能區(qū)別HER2陽性腫瘤和陰性腫瘤。卵巢癌SK-OV-3移植瘤對89Zr-曲妥珠單抗的攝取高達30% ID/g，且其生物分布與111In-曲妥珠單抗相似。研究表明，89Zr-曲妥珠單抗還可定量監(jiān)測HER2在治療后表達水平的變化。89Zr-曲妥珠單抗顯像表明熱休克蛋白90(hsp90)抑制劑治療后腫瘤 HER2的表達水平明顯降低[50]。89Zr-曲妥珠單抗還可用于EGFR/HER2/HER4抑制劑阿法替尼的療效評價。18F-FDG的攝取在阿法替尼治療后并沒有改變，而89Zr-曲妥珠單抗在治療后的攝取明顯減少。89Zr-曲妥珠單抗攝取與HER2表達水平相關(guān)。因此，89Zr-曲妥珠單抗PET顯像可能是一種HER2陽性腫瘤的定性、治療計劃制定以及療效監(jiān)測的有效工具。

2010年， Dijkers等[51]首次報告了利用89Zr-Trastuzumab進行的HER2陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者顯像。研究表明，89Zr-trastuzumab的理想顯像時間點以及最佳放射性活度取決于患者的治療情況。如果患者已經(jīng)用曲妥珠單抗進行治療，要取得最好的顯像結(jié)果需使用89Zr-trastuzumab和未標記的抗體的混合物?？傮w而言，腫瘤對89Zr-Trastuzumab的攝取很高。最佳評估時間是在注射89Zr-曲妥珠單抗后4～5 d。盡管曲妥珠單抗無法穿透血腦屏障，但還是檢測到了腦轉(zhuǎn)移病灶，可能由于腦轉(zhuǎn)移病人的血腦屏障被破壞，89Zr-曲妥珠單抗可以通過。在這項研究中HER2過表達的病灶可以從不表達HER2的病灶中分辨出來。這些數(shù)據(jù)表明使用89Zr-Trastuzumab可以提高HER2陽性乳腺癌患者尤其是不適宜活檢者的診斷效果。

3.5靶向血管內(nèi)皮生長因子

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是重要的血管生成因子，由至少六種不同數(shù)量的氨基酸(121，145，165，183，189，和206個氨基酸)通過選擇性剪接產(chǎn)生，誘導細胞增殖，遷移，分化和內(nèi)皮細胞管腔形成。血管生成因子在新生血管生成過程中起核心作用，已知的重要成員有VEGF家族，肝細胞生長因子家族和纖維生成因子家族等，其中VEGF家族是研究最廣泛的一族，包括VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E及胎盤生長因子等[52]。VEGF存在腫瘤和正常組織中，它的過度表達和受體VEGFR，都與預后差有關(guān)。人工抗VEGF的單克隆抗體，如貝伐單抗，已被批準用于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌和非小細胞肺癌的臨床應用。與89Zr-IgG相比，89Zr-貝伐單抗在SKOV-3卵巢癌移植瘤攝取更高。另外，89Zr-貝伐單抗還用作腫瘤微環(huán)境的VEGF表達PET示蹤劑，以及檢測抗血管生成響應。hsp90在VEGF轉(zhuǎn)錄中有重要作用，可以治療卵巢癌。89Zr-貝伐單抗在A2780腫瘤的攝取與hsp90抑制劑NVP-AUY922的作用相關(guān)[53]。另一項研究表明mTOR抑制劑依維莫司，能讓89Zr-貝伐單抗腫瘤攝取降低[54]。所以89Zr-貝伐單抗可以檢測mTOR抑制劑早期治療后腫瘤VEGF-A水平。23例乳腺癌患者(26個病灶)注射37 MBq89Zr-貝伐單抗后4 d對乳房和腋窩區(qū)域行PET/CT掃描。89Zr-貝伐單抗檢測出25個(96.1%)病灶。該研究表明，89Zr-Bevacizumab可用于乳腺腫瘤的分類和監(jiān)測及預后VEGF靶向治療效果[55]。

蘭尼單抗是貝伐單抗的衍生物，89Zr-蘭尼單抗可用于監(jiān)測早期舒尼替尼的抗血管生成反應。89Zr-蘭尼單抗PET與細胞組織學、免疫組織化學、細胞增殖和血管再生分析的結(jié)果，較18F-FDG PET和15O-H2O PET更一致。蘭尼單抗血清半衰期為2～6 h，所以89Zr-蘭尼單抗PET可進行多次掃描評估腫瘤對VEGF抑制劑的響應[56]。

3.6靶向前列腺特異性膜抗原(PSMA)

PSMA是一類Ⅱ型跨膜糖蛋白，相對分子質(zhì)量約為100 kD，共含750個氨基酸，由前列腺上皮細胞分泌，是一種多功能蛋白，具有多種蛋白酶活性，參與營養(yǎng)物質(zhì)的攝取及跨膜信號的轉(zhuǎn)導和細胞的內(nèi)化作用，與腫瘤增殖、去雄抵抗、荷爾蒙治療抵抗有關(guān)[57]。PSMA在正常組織表達有限，但在前列腺癌組織中高度表達。89Zr標記單抗J591(89Zr-DFO-J591)放化產(chǎn)率大于77%，放化純度大于99%。體內(nèi)實驗顯示，注射89Zr-DFO-J591后24、48、96、144 h前列腺癌LNCaP攝取分別為(34.4±3.2) %ID/g、(38±6.2) %ID/g、(40.4±4.8) %ID/g、(45.8±3.2) %ID/g。圖像對比度良好，腫瘤與肌肉的比例大于20。89Zr-DFO-J591可定性和定量分析體內(nèi)PSMA陽性或陰性的前列腺癌腫瘤[58]。

3.7靶向碳酸酐酶Ⅸ

碳酸酐酶(CA Ⅸ)是一組含鋅酶，目前發(fā)現(xiàn)CA至少有14種同工酶，其中碳酸酐酶Ⅸ是最重要的一種。CA Ⅸ是一個腫瘤相關(guān)蛋白，由于其在多種腫瘤組織中高度表達而在正常組織中幾乎不表達，近年來成為一個潛在的抗癌靶點[59]。CA Ⅸ在缺氧細胞如腫瘤組織中高度表達，這與放療和化療抵抗有關(guān)。Hoeben等[59]用89Zr標記了CG250抗體的一個片段F(ab’)2，利用小動物PET研究89Zr-F(ab’)2-CG250 的藥代性能。模型鼠注射4 h后，移植瘤內(nèi)出現(xiàn)放射性聚集，但是24 h后濃聚開始減少，89Zr-F(ab’)2-CG250的濃聚部位與CA Ⅸ表達的部位相一致。在很多腫瘤類型中，CA Ⅸ是一種與缺氧有關(guān)的細胞標志物，核素標記的CA Ⅸ單抗可能篩選出適宜缺氧靶向或缺氧修飾療法的患者。例如，89Zr-F(ab’)2-CG250可用于人頭頸部鱗狀上皮基底細胞癌(SCCNij3)荷瘤小鼠的腫瘤缺氧可視化。荷腎透明細胞癌(ccRCC)模型鼠研究表明，與124I-cG250相比，89Zr-cG250更加靈敏。靶向CA Ⅸ的89Zr-標記抗體可作為多種腫瘤缺氧的PET顯像劑，值得深入研究[60-61]。

3.8靶向胰島素樣生長因子受體1

胰島素樣生長因子受體1(IGF-1R)是一種跨膜受體，屬于受體酪氨酸激酶(RTK)，基因定位于染色體15q25-26，在核糖體中合成，在多種人類腫瘤中表達，包括三陰性乳腺癌[62]。它與增生、細胞凋亡、血管再生和腫瘤入侵有關(guān)。IGF-1R不但對正常組織有增殖效應，而且也是細胞惡性轉(zhuǎn)化的前提，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在惡性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤組織中呈高表達。這使IGF-1R成為一個極具吸引力的腫瘤靶點，有望作為腫瘤的早期診斷、治療和預后指標[63]。Heskamp等報道了111In-R1507和89Zr-R1507 (靶向IGF-1R)在SUM149三陰性乳腺癌移植瘤小鼠中的攝取，表明89Zr-R1507用于IGF-1R可用于靶向診斷[64]。

4結(jié)論

89Zr標記藥物分辨率高，與靶向組織特異性結(jié)合且對比度良好，在PET成像領(lǐng)域中應用前景廣泛。但仍存在一些挑戰(zhàn)，比如核素發(fā)出的高能量光子會導致圖像背景干擾，螯合體和蛋白質(zhì)之間的共價鍵斷裂致使穩(wěn)定性有限等。因此，進一步研究螯合劑和共軛策略，開發(fā)具有優(yōu)化特性的89Zr標記化合物，可為臨床提供更精準的診斷和療效監(jiān)測信息。

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Development of89Zr Labelled Radiopharmaceuticals

WANG Li-zhen, YANG Min

(KeyLaboratoryofNuclearMedicine,MinistryofHealth,JiangsuKeyLaboratoryofMolecularNuclearMedicine,JiangsuInstituteofNuclearMedicine,Wuxi214063,China)

Abstract:Positron emission tomography (PET) is the most advanced molecular imaging technology with the advantage of high sensitivity and quantity analysis. Molecule probe is the key factor for PET.89Zr is a novel imaging nuclide and suitable for labeling macromolecular bioactive substances such as antibody due to its favorably long half-life and energy. This review outlined the recent development of the production of89Zr, labeling methods and application of89Zr labelled radiopharmaceuticals.

Key words：89Zr; PET; radiopharmaceuticals; labeling

收稿日期：2015-11-04;修回日期：2016-02-14

基金項目：國家自然科學基金項目(21504034，81472749，81401450，51473071)；江蘇省衛(wèi)生廳項目(H201529)；江蘇省自然科學基金項目(Q201406)；江蘇省科技支撐計劃項目(BE2014609)；江蘇省333資助(BRA2015476)

作者簡介：王立振(1984—)，男，實習研究員，核醫(yī)學與分子影像專業(yè) 通信作者：楊敏(1972—)，研究員，核醫(yī)學與分子影像專業(yè)，E-mail: yangmin@jsinm.org

中圖分類號：TL364.5

文獻標志碼：A

文章編號：1000-7512(2016)02-0121-08

doi：10.7538/tws.2016.29.02.0121