文/ Yu Wang

藥用植物活性成分的研究

文/ Yu Wang

針對藥用植物提取物的生物活性成分進(jìn)行深度研究

國際糖尿病聯(lián)合會2015年公布數(shù)據(jù)顯示：全球大約有4.15億糖尿病患者，且有著迅速增加的趨勢。因此，糖尿病治療方案也迅速成為熱門。本文主要研究如何從降糖藥中提取藥用植物活性成分。

幾個世紀(jì)以來，多種藥用植物在亞洲一直被用來降血糖，但它們的植物藥性和作用機(jī)制一直都是未知的。我們進(jìn)行研究的目的就在于評估匙羹藤對鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的抑制作用。匙羹藤是中國傳統(tǒng)中藥中用來降血糖的幾種常用藥用植物之一。

提取物的制備

干匙羹藤葉（300 g）研磨成微細(xì)的粉末，然后依次用戊烷（2×2 L）、甲醇/水（7/3，體積/體積，2×2 L）和甲醇（2×2 L）萃取。將兩種極性的萃取物，即第二和第三提取液合并到一起，并用Genevac公司的Rocket蒸發(fā)器（參見圖1）除去稀釋劑。殘留物冷凍干燥之后，極性分餾物II就顯現(xiàn)出來了。由于冷凍干燥設(shè)備有著很好的操作處理性能（輕松、方便地稱量固體物質(zhì)），因此冷凍干燥工藝技術(shù)就是這一項目中樣本制備的最佳選擇。在冷凍干燥時，必須首先去除有機(jī)稀釋劑。遺憾的是，利用甲醇/水萃取匙羹藤時產(chǎn)生的泡沫太多，導(dǎo)致無法利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器來去除稀釋劑。

圖1.Genevac公司用于清除稀釋劑的Rocket型蒸發(fā)器（左）和它所使用的能在任意容器內(nèi)完成干燥的蒸發(fā)瓶系統(tǒng)（右）。

Genevac公司的Rocket蒸發(fā)器則相反，它不僅允許無人值守的情況下，清除有機(jī)相及兩種稀釋劑，而且還能預(yù)防泡沫的生成。它的蒸發(fā)瓶系統(tǒng)Rocket Sample Genie（參見圖1）允許您選用合適的容器，直接在這一容積中完成干燥。一個小容積的玻璃瓶可以通過合適的專用瓶接頭直接與250 ml的玻璃瓶連接起來。稀釋劑在大瓶中蒸發(fā)，干燥后的樣本留在小玻璃瓶中，蒸發(fā)、干燥后可取走小瓶。

按照這種方法可以省去許多耗費時間的樣本轉(zhuǎn)移中間步驟。在Rocket蒸發(fā)器和Sample Genie蒸發(fā)瓶的幫助下，1.35 L的甲醇和甲醇/水萃取物，即6×250 ml瓶的液體在一天時間內(nèi)完成干燥。除此以外，干燥后的有用物質(zhì)都被收集在玻璃小瓶中，然后根據(jù)蒸發(fā)前稱量的空瓶凈重可以馬上確定萃取物的萃取量了。

對SGLT1的抑制作用

在測定這一藥用植物時，用cRNA探針在非洲爪蟾的卵中注射了微量hSGLT1高親和力的鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1，然后利用有兩個電極的全細(xì)胞電壓鉗在葡萄糖誘導(dǎo)性傳輸流穿過卵膜，并進(jìn)行功能分析。在分離匙羹藤極性分餾物II的SGLT1鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1抑制劑時采用了含水（分餾物II-1）的反相高效液相色譜技術(shù)RPMPLC和含甲醇（分餾物II-2）的分析柱。在有機(jī)稀釋劑蒸發(fā)之后，對冷凍干燥的分餾物II-1和II-2的SGLT1鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的生物活性進(jìn)行了測定。

分餾物II-2有著明顯的SGLT1鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的抑制作用。對分餾物進(jìn)一步在正相色譜法RP-MPLC中進(jìn)行提純，提純后得到的八份提取物（II-2/A至II-2/H）重新進(jìn)行SGLT1的抑制活性測試（參見圖2）。

亞組分II-2/B顯示出了很強(qiáng)的SGLT1鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1抑制作用，抑制率高達(dá)80%，因此利用RP-HPLC反相高效液相色譜法重新進(jìn)行SGLT1的抑制活性測試?？偣彩占?6個反相高效液相色譜的檢測分析結(jié)果。用Genevac公司的Rocket蒸發(fā)器去除了其中的有機(jī)稀釋劑、對樣本進(jìn)行了冷凍干燥，在天然濃度比下進(jìn)行了SGLT1的抑制活性測試（參見圖3）。

對SGLT1鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1抑制效率最高的是HPLC色譜法檢測得到的分餾物22和24（45%及48%）。利用LC-MS/MS高效液相色譜-質(zhì)譜微量元素分析法、UPLC-TOF-MS超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀和一維/二維核磁共振這些分餾物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測定。檢測得到的匙羹藤酸V（結(jié)構(gòu)式1）和XV（結(jié)構(gòu)式2）的結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

圖2.從匙羹藤中提取出來的分餾物II-2/A至II-2/H對α-甲基葡萄糖誘導(dǎo)的SGLT1傳輸流抑制作用的測試圖譜。

圖3.（1mmol）α-甲基葡萄糖誘導(dǎo)的SGLT1傳輸流抑制作用的測試圖譜,所使用的抑制劑樣本是HPLC分餾出來的冷凍干燥樣品，其濃度比相當(dāng)于（從II-2組匙羹藤提?。┓逐s物的原始濃度。

圖4.匙羹藤酸V（結(jié)構(gòu)式1）和匙羹藤酸XV（結(jié)構(gòu)式2）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

小結(jié)

已經(jīng)非常明確的是，大白鼠在口服匙羹藤酸之后血糖水平會明顯降低，但其基本作用機(jī)制目前尚未完全查明。在后續(xù)的研究中，hSGLT1高親和力的鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的生物活性測定結(jié)果顯示，匙羹藤酸對鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1有著很高的抑制作用。在匙羹藤中，匙羹藤酸V和匙羹藤酸XV有著最高的SGLT1鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1抑制作用。在皮上細(xì)胞刷狀緣上，SGLT1鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的濃度最高，這一研究顯示了利用三萜類在腸胃道抑制葡萄糖吸收的可能性。 LP

本文作者來自慕尼黑技術(shù)大學(xué)食品化學(xué)和分子傳感器系。