唐朋林郭 勇

溫陽活血法對寒凝血瘀證荷CT-26小鼠肺組織MMPs及ERK的影響

唐朋林1郭 勇2

目的觀察寒凝血瘀狀態(tài)及溫陽活血法對腫瘤轉移靶組織微環(huán)境的影響。方法建立寒凝血瘀證荷瘤小鼠復合動物模型。將48只Balb/c小鼠隨機分為空白對照組、單純荷瘤組、寒凝血瘀荷瘤組、溫陽活血治療組，每組12只，分別造模，Western blot方法檢測各組小鼠肺組織MMPs及ERK的表達。結果與單純荷瘤組比較，寒凝血瘀荷瘤組小鼠ERK1/2、MMP-2表達均升高[ERK1/ 2 RI值：（1.40±0.01）比（0.98±0.03），P＜0.05]；[MMP-2 RI值：（1.26±0.05）比（1.00±0.04），P＜0.05]；與寒凝血瘀荷瘤組比較，溫陽活血治療組小鼠ERK1/2、MMP-2表達均降低 [ERK1/2 RI值：（1.18± 0.01）比（1.40±0.01），P＜0.05]；[MMP-2 RI值：（1.01±0.05）比（1.26±0.05），P＜0.01]。與寒凝血瘀荷瘤組比較，溫陽活血治療組小鼠MMP-12表達升高[MMP-12 RI值：（1.23±0.03）比（1.08±0.06）（P＜0.05）]。結論溫陽活血法通過下調荷瘤小鼠腫瘤轉移靶器官肺組織ERK1/2、MMP-2表達及上調MMP-12從而影響腫瘤基質及腫瘤血管生成，進而減少轉移灶形成的發(fā)生率。

小鼠；荷CT-26結腸腺癌細胞；寒凝血瘀證；溫陽活血法；MMP-2；MMP-12；ERK1/2

轉移和侵襲是惡性腫瘤的基本生物學特征，控制轉移是決定腫瘤患者預后的關鍵因素。腫瘤轉移是宿主、腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境之間多因素相互作

用的復雜過程。允許腫瘤生長的轉移靶組織微環(huán)境變化活化先于癌細胞轉移，為腫瘤向該組織轉移提供有利條件。中醫(yī)理論解讀腫瘤的發(fā)生與發(fā)展也是機體內(nèi)環(huán)境諸多陰陽平衡被打破的惡性循環(huán)的過程[1]，這與腫瘤轉移微環(huán)境的理論不謀而合。根據(jù)辨證論治原則，針對腫瘤患者不同證候類型施以不同治則治法，以期恢復機體內(nèi)環(huán)境平衡，達到降低腫瘤轉移發(fā)生率。血瘀證是惡性腫瘤患者的主要證候之一，“寒”是腫瘤晚期患者的又一特點，寒凝血瘀為血瘀證常見亞型之一[2]。肺組織是腫瘤轉移常見的靶器官，這可能與肺組織中毛細血管密集，為腫瘤細胞的增殖提供便利條件，并且大量的肺泡巨噬細胞分泌多種細胞因子，促進細胞運動、侵襲及新生血管生成有關。本研究從腫瘤新生血管與腫瘤細胞降解細胞基底膜及細胞外基質方面著手，通過檢測轉移靶器官肺組織中MMP-2、MMP-12、ERK1/2的表達以分析寒凝血瘀狀態(tài)及溫陽活血法對腫瘤轉移的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康8周齡雌性Balb/c小鼠48只，體質量（20±2）g，由中國醫(yī)學科學院上海實驗動物中心提供，合格證號：上海西普爾-必凱實驗動物有限公司SCXK（滬）2008-0016。SPF條件下飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心B區(qū)：溫度（24±2）℃，濕度（55±5）%，噪音＜50db，每12h予亮暗循環(huán)，2周更換1次敷料，用無菌營養(yǎng)顆粒飼料飼養(yǎng)。

1.2 實驗瘤株 小鼠結腸腺癌細胞CT-26 colon cancer，購自上海細胞庫。

1.3 藥物及主要試劑 0.9%NaCl（常州康普藥業(yè)有限公司，批號0905025）；0.1%鹽酸腎上腺素（天津金耀氨基酸有限公司，批號H12020526）；Tris、Triton X-100（ANDYBOY公司）；過硫酸銨（愛建德固賽引發(fā)劑有限公司）；丙烯酰胺（Bio-Rad公司）；十二烷基磺酸鈉（AMRESCO公司）；Tween20、Temed（Bio-Rad公司）；Marker（Ferment公司）甘氨酸（AMRESCO公司）；化學發(fā)光試劑A、B（Millipore Corparation公司）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（Santa Cruz公司）；兔抗MMP-2一抗、兔抗MMP-12一抗（Epitomics公司）；兔抗ERK1/2、兔抗pERK1/2、鼠抗β-actin一抗（CST公司）；RIPA細胞裂解液（Roch公司）；RMPI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司）；0.4%臺盼蘭溶液、Brij-35（AMRESCO公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；0.25%胰酶-EDTA（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）；蛋白定量試劑盒A、B（Bio-rad公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組 應用計算機生成的隨機數(shù)字表將48只8周齡Balb/c小鼠隨機分為四組：空白對照組、單純荷瘤組、寒凝血瘀荷瘤組、溫陽活血治療組，每組12只。

2.2 造模方法 （1）空白對照組：每天定點小鼠皮下靜脈注射無熱源生理鹽水0.2mL,隔天1次,連續(xù)2周。2周后復予皮下注射無熱源生理鹽水0.2mL，隔天1次，連續(xù)4周。（2）單純荷瘤組：每天定點小鼠皮下靜脈注射生理鹽水0.2mL,隔天1次,連續(xù)2周。2周后每只小鼠右前肢腋部皮下接種C26單細胞懸液（密度=4×106個/mL）0.2mL。24h后復予皮下注射無熱源生理鹽水0.2mL，隔天1次，連續(xù)4周。（3）寒凝血瘀荷瘤組：每天定點小鼠皮下注射0.1%腎上腺素0.08mL/kg（用生理鹽水稀釋到0.2mL），分兩次注射，第1次注射后1h，進行冰?。?～6℃）4min，連續(xù)2周，2周后每只小鼠右前肢腋部皮下接種C26單細胞懸液（密度=4×106個/mL）0.1mL。皮下接種24h后維持造模，隔天1次，連續(xù)4周。（4）溫陽活血治療組：同寒凝血瘀荷瘤組。

2.3 中藥干預 中藥煎劑選用溫陽活血代表方劑血府逐瘀湯合當歸四逆湯加減（桃仁、紅花、川芎各12g，生地15g，赤芍、牛膝、柴胡各12g，枳殼6g，桔梗12g，當歸 15g，桂枝 12g，芍藥 15g，甘草 6g，大棗15g）。原生藥材購自浙江中醫(yī)藥大學制劑室，按傳統(tǒng)工藝將藥物加水反復濃煎，濃縮至生藥含量為1.68g/ mL濃度的中藥水煎劑，密封，4°C保存，臨用前稀釋。溫陽活血治療組小鼠瘤體接種24h后開始中藥灌胃，藥量換算方法以陳奇推薦的換算法[3]為依據(jù)，根據(jù)成人每天每60kg體質量藥量的10倍推算出等效劑量0.28g/（10g·d）按比例稀釋至0.2mL中藥煎劑灌胃，每天1次，連續(xù)4周。

2.4 動物觀察 參照相關文獻[4-7]評價小鼠寒凝血瘀證模型，動物模型寒凝血瘀證候的相關觀測指標包括：一般情況（外在癥狀、體溫、毛發(fā)情況、耳廓毛細血管網(wǎng)外觀）、實驗室指標（全血黏度、局部微血管血流值）。瘤體接種觀察：造模第2周瘤細胞皮下接種后每天觀察各組荷瘤小鼠瘤體大小。

2.5 標本采集及檢測 于造模第42天通過微循環(huán)多普勒儀器檢測各組小鼠耳朵、腳趾、腹部血管的血流值，每只小鼠取血送檢全血黏度，然后采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，解剖并取出全部肺組織，固定于10%福爾馬林，部分肺組織HE染色；部分肺組織采用Western blot檢測MMP-2、MMP-12、pERK1/2蛋白濃度。

2.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析處理。依各數(shù)據(jù)類型分別采用方差分析（F檢驗、多樣本均數(shù)間多重比較的Dunnett-t檢驗及LSD-t檢驗），率的比較用χ2檢驗。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s） 表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 模型評價 單純荷瘤組、寒凝血瘀荷瘤組、溫陽活血治療組小鼠右前肢腋部皮下接種C26單細胞懸液1周左右后接種部位出現(xiàn)位置固定、質地稍軟的實體腫塊，隨后腫瘤結節(jié)逐漸增大，荷瘤小鼠皮下移植瘤接種成功率為100%（36/36）。除空白對照組小鼠外，各組小鼠均有消瘦及被毛脫落、動作遲緩等癥狀；寒凝血瘀荷瘤組、溫陽活血治療組小鼠在造模開始后出現(xiàn)畏寒喜暖,食少便稀,倦縮少動，毛發(fā)變黃、枯槁，雙眼球顏色變暗紅，爪甲逐漸紫暗，耳緣毛細血管顏色由紅逐漸變深紅甚至紫紅等寒凝血瘀證癥狀，空白對照組及單純荷瘤組小鼠無寒凝血瘀證典型表現(xiàn)。寒凝血瘀荷瘤組、溫陽活血治療組各小鼠的耳緣血管、腳趾及腹壁靜脈所測得血流值均小于空白對照組及單純荷瘤組小鼠，見表1，血黏度值檢測明顯高于空白對照組及單純荷瘤組小鼠，見表2，提示寒凝血瘀荷瘤組、溫陽活血治療組各小鼠血液處于高黏滯狀態(tài),結合寒凝血瘀證典型表現(xiàn)說明本研究小鼠寒凝血瘀證模型建立成功。

表1 各組小鼠局部微循環(huán)血流量（±s）

表1 各組小鼠局部微循環(huán)血流量（±s）

注：與單純荷瘤組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白對照組單純荷瘤組寒凝血瘀荷瘤組溫陽活血治療組只數(shù)12 12 12 12耳緣42.9±2.78 35.6±5.1 33.8±3.2** 35.0±5.8*腳趾49.4±8.17 33.4±1.9 29.6±1.4* 32.7±2.1*腹壁95.1±9.8 74.0±4.0 64.0±5.4** 69.9±13.0*

表2 各組小鼠全血黏度比較（mps.s，±s）

表2 各組小鼠全血黏度比較（mps.s，±s）

注：與單純荷瘤組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白對照組單純荷瘤組寒凝血瘀荷瘤組溫陽活血治療組只數(shù)12 12 12 12低切27.66±1.0 35.61±1.1 48.87±1.8* 44.40±2.0*中切5.70±0.40 6.61±0.55 8.25±2.75* 7.68±0.55*高切3.07±0.29 4.89±0.27 7.04±1.40** 5.22±0.18*

3.2 各組小鼠免疫組化檢測結果 48只雌性Balb/c小鼠的肺臟進行免疫組化檢測及HE染色，病理切片上均未發(fā)現(xiàn)C26細胞轉移灶，亦未發(fā)現(xiàn)異常血管生成、腫瘤原發(fā)灶及其它癌前病變。

3.3 各組小鼠Western blot結果 與單純荷瘤組小鼠比較，寒凝血瘀荷瘤組MMP-2（P＜0.05），pERK1/2表達升高（P＜0.05）。與寒凝血瘀荷瘤組小鼠比較，溫陽活血治療組小鼠MMP-2表達降低（P＜0.01），pERK1/2表達降低（P＜0.05）。與單純荷瘤組小鼠比較，寒凝血瘀荷瘤組小鼠MMP-12表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與寒凝血瘀荷瘤組比較，溫陽活血治療組小鼠MMP-12表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠RI值比較（±s）

表3 各組小鼠RI值比較（±s）

注：與單純荷瘤組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與寒凝血瘀荷瘤組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別空白對照組單純荷瘤組寒凝血瘀荷瘤組溫陽活血治療組只數(shù)12 12 12 12 MMP-2 0.67±0.06 1.00±0.04 1.26±0.05* 1.01±0.05△△pERK1/2 0.73±0.01 0.98±0.03 1.40±0.01* 1.18±0.01△MMP-12 0.69±0.03 0.66±0.06 1.08±0.06 1.23±0.03△

4 討 論

早在1889年，Paget提出器官微環(huán)境（“土壤”）可影響特定腫瘤細胞（“種子”）的種植、侵襲、存活、生長，腫瘤轉移早期常呈現(xiàn)特異臟器親合性，允許腫瘤生長的原發(fā)腫瘤器官及轉移器官微環(huán)境，腫瘤細胞與宿主細胞間相互作用均是決定腫瘤轉移的重要因素等[8]。部分學者認為腫瘤轉移靶組織活化先于癌細胞轉移，靶組織的微環(huán)境變化對腫瘤向該組織轉移提供了有利條件[9-11]。在腫瘤微環(huán)境中主要包含了多種非惡性的支持基質細胞，其在腫瘤細胞誘導下在其周圍產(chǎn)生大量的生長因子、黏附分子、趨化因子以及基質降解酶以促進血管生成和基底膜破壞，使腫瘤的侵襲能力增強[12]。MMP-2是人體內(nèi)降解細胞外基質的主要酶類，相關研究[13-15]表明MMP-2高表達的患者相對于MMP-2低表達患者總的生存率明顯縮短。MMP-12過表達結腸癌患者其腫瘤浸潤深度、淋巴管及血管浸潤程度均好于MMP-12陰性表達者，在抗腫瘤和抗血管生成方面有重要作用[16-17]。ERK1/ERK2主要功能是將細胞外各種環(huán)境因素變化的信息傳遞至胞內(nèi)，抑制ERK/MAPK信號通路的轉導在體外能使腫瘤細胞恢復到非轉化的狀態(tài)，在體內(nèi)則能抑制腫瘤的生長[18-19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，寒凝血瘀狀態(tài)對小鼠自發(fā)性結腸癌肺轉移模型中MMP-2、ERK1/2的表達具有一定的促進作用，采用溫陽活血化瘀中藥干預后可下調MMP-2、ERK1/2的表達；對于寒凝血瘀狀態(tài)荷瘤小鼠采用溫陽活血化瘀中藥干預后可一定程度上促進MMP-12的表達。由此得出，寒凝血瘀狀態(tài)可以促進腫瘤轉移發(fā)生，采用溫陽活血法干預寒凝血瘀狀態(tài)可改善腫瘤靶組織轉移的微環(huán)境，從而降低腫瘤轉移率。

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（收稿：2016-02-08 修回：2016-04-30）

Effects of Yang-warming and Blood-activating Therapy on MMPs and ERK in Mice with Colorectal Tu-morwith Chinese Differentiation Syndrome of Cold Coagulation and BloodStasis

TANG Penglin1,GUO Yong21 Department of Internal Medicine,the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310005),China；2 Department of Internal Medicine,the First AffiliatedHospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of Chinese medicine cold coagulation and blood stasis syndrome and Yang-warming and blood-activating therapy on tumor metastasis.MethodsForty-eight Balb/c mice were randomly divided into 6 groups：blank control group,tumor-bearing group,tumor-bearing+cold coagulation and blood stasis syndrome group（control group with tumor bearing）,tumor-bearing+cold coagulation and blood stasis syndrome+herb medicine group（treatment group）,with 12 mice in each group.Except for blank control group,cold coagulation and blood stasis syndrome model was established in other groups.The expression of MMPs and ERK in lung tissue was determined by western blot assay.ResultsCompared with tumor-bearinggroup,ERK1/2 and MMP-2 of control group with tumorbearing were higher（ERK1/2 RI value：1.40±0.01 vs 0.98±0.03;MMP-2 RI value：1.26±0.05 vs1.00±0.04;all P＜0.05）.Compared with control group with tumorbearing,treatment group had decreased ERK1/2（RI value：1.18±0.01 vs 1.40±0.01,P＜0.01）and MMP-2（RI value：1.01±0.05 vs 1.26±0.05;all P＜0.01）, but increased MMP-12 level（RI value：1.23±0.03 vs 1.08±0.06，P＜0.05）.ConclusionYang-warming and bloodactivating therapy can decrease the expression of ERK1/2 and MMP-2 and increase MMP-12 of lung tissuein tumor-bearing mice to influence tumor stroma and the formation of tumor vessels and consequently reduce the incidence of tumor metastasis.

mice;CT-26 cancer cells;cold coagulation and blood stasis;Yang-warming and blood-activating therapy;MMP-2;MMP-12;ERK1/2

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2012ZA049）

1浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（杭州 310005）；2浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（杭州 310006）

郭勇，Tel：13588887292；E-mail：guoyong1047@163.com