宋 聰，黃亞麗*，謝晨星,2，賈振華，徐 文,2

(1.河北省科學(xué)院 生物研究所/河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050081；2.河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130)

冬棗黑斑病菌拮抗菌株的篩選鑒定及其對(duì)該病的防治作用

宋 聰1，黃亞麗1*，謝晨星1,2，賈振華1，徐 文1,2

(1.河北省科學(xué)院 生物研究所/河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050081；2.河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130)

為給冬棗(ZiziphusjujubeMill.)黑斑病的生物防治提供優(yōu)良菌株資源，以冬棗黑斑病菌為靶標(biāo)，從冬棗健果中進(jìn)行拮抗微生物資源的篩選。利用梯度稀釋法從健康冬棗果實(shí)表面分離出細(xì)菌397株，其中K5-4對(duì)冬棗黑斑病菌的抑菌效果最為明顯，抑菌帶寬度為10.06 mm，該菌的無(wú)菌發(fā)酵液也具有良好的抑菌活性?；铙w防病試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌能夠有效地抑制冬棗黑斑病的發(fā)生，濃度為1×108cfu/mL時(shí)對(duì)黑斑病的防效為78.50%。該菌能夠在冬棗果實(shí)中定殖，在接種后48 h內(nèi)K5-4菌數(shù)增長(zhǎng)為初始值的31.62倍，有無(wú)黑斑病病原菌存在對(duì)K5-4的定殖影響不大。 通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA 序列同源性分析，鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，其在防治冬棗黑斑病上有較好的應(yīng)用前景。

冬棗； 黑斑病； 細(xì)交鏈格孢； 生物防治； 解淀粉芽孢桿菌； 防效

冬棗是我國(guó)稀有的優(yōu)質(zhì)晚熟鮮食棗果品種，以其豐富的營(yíng)養(yǎng)、優(yōu)良的品質(zhì)備受消費(fèi)者的青睞。黑斑病是冬棗上一種危害非常嚴(yán)重的病害，使棗果產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降、不耐貯存，嚴(yán)重影響了棗果的商品性[1-2]。該病害于2003年首次在河北、山東大面積發(fā)生，之后在全國(guó)冬棗產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病棗園的發(fā)病率在20%以上，病情嚴(yán)重者發(fā)病率可達(dá)80%，給棗農(nóng)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前，對(duì)該病害的防治主要采取多次噴施化學(xué)農(nóng)藥，造成了化學(xué)農(nóng)藥的過(guò)量使用和嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留。尋求安全、經(jīng)濟(jì)、有效的冬棗黑斑病防治方法成為保證冬棗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。

植物病害的生物防治被認(rèn)為是最有希望替代化學(xué)殺菌劑的方法之一并已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展[4-6]。然而，由于冬棗的分布范圍較小，規(guī)?；N植年限短，目前對(duì)冬棗病害生物防治的研究相對(duì)較少。國(guó)內(nèi)相關(guān)的研究包括耿海峰等[7]從土壤中定向篩選了1株枯草芽孢桿菌，薛夢(mèng)林等[8]從冬棗果面上分離出1株成團(tuán)泛菌B501，郭東起等[9]從冬棗果面上分離出1株美極梅奇酵母菌， 這3株菌均對(duì)采后冬棗黑斑病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，并在室內(nèi)條件下能夠降低冬棗黑斑病的發(fā)生。 進(jìn)行更大范圍的冬棗黑斑病菌拮抗微生物的篩選，為冬棗黑斑病生物防治儲(chǔ)備更多的微生物資源，是加快冬棗病害生物防治進(jìn)程的前提和基礎(chǔ)。本研究以冬棗黑斑病菌為靶標(biāo)，從冬棗健果中進(jìn)行拮抗微生物資源的篩選，研究其對(duì)冬棗黑斑病病原菌的拮抗機(jī)制及防治效果，以期為冬棗黑斑病的采前、采后防治提供良好的微生物資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣品采集：2013年8月5日至10月10日即冬棗黑斑病的主要發(fā)病期內(nèi)，在河北省滄州、石家莊、邯鄲、邢臺(tái)的冬棗發(fā)病果園，采集冬棗健康果實(shí)。

拮抗菌分離培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基；平板對(duì)峙試驗(yàn)培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

冬棗黑斑病菌：細(xì)交鏈格孢6-2a為本研究中心分離鑒定并保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 冬棗健康果實(shí)表面細(xì)菌的分離 以從河北滄州、衡水、邯鄲等地區(qū)冬棗園中采摘的健康冬棗果實(shí)為材料，用0.05 mol/L的磷酸緩沖液在搖床上100 r/min搖10 min，棄去洗液，再將果實(shí)放入磷酸緩沖液中，用超聲波清洗器清洗30 min，取洗液。將洗液梯度稀釋后，吸取稀釋液100 μL到LB培養(yǎng)基上，涂布后28 ℃ 培養(yǎng)2～3 d，挑取形態(tài)各異的菌落進(jìn)行純化和保存。

1.2.2 冬棗黑斑病菌拮抗菌株的篩選 用打孔器打取直徑為3 mm的細(xì)交鏈格孢6-2a菌塊接種到PDA平板中央，采用十字交叉法將待測(cè)菌株點(diǎn)接在距平板中央 3 cm 處，28 ℃恒溫培養(yǎng) 5 d 后，測(cè)量抑菌帶寬度，以抑菌帶為指標(biāo)選擇出拮抗作用較強(qiáng)的菌株。

1.2.3 不同處理方式的拮抗菌K5-4發(fā)酵液對(duì)細(xì)交鏈格孢的抑制作用測(cè)定 將拮抗菌K5-4在LB液體培養(yǎng)基中28 ℃ 培養(yǎng)2 d，之后將發(fā)酵液配制成拮抗菌LB發(fā)酵液(1×108cfu/mL)、拮抗菌無(wú)菌水懸液( 1×108cfu/mL )、無(wú)菌發(fā)酵液(0.22 μm濾膜過(guò)濾)、無(wú)菌發(fā)酵液熱處理液(121 ℃，20 min)。在PDA平板中央接種直徑為3 mm的細(xì)交鏈格孢菌塊，距離接種菌塊3 cm處按十字交叉法打4個(gè)直徑為5 mm的洞，每個(gè)洞中分別加入上述4種拮抗菌處理液100 μL。28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后測(cè)量抑菌帶的寬度。

1.2.4 拮抗菌K5-4無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)冬棗黑斑病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的影響測(cè)定 用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)6 d的細(xì)交鏈格孢菌落獲得孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整孢子濃度為1×106cfu/mL，分別將拮抗菌無(wú)菌發(fā)酵液和細(xì)交鏈格孢孢子懸浮液各 30 μL加入凹玻片內(nèi)，于25 ℃在濾紙保濕培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每8 h鏡檢觀察孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)情況。以L(fǎng)B液體培養(yǎng)基代替拮抗菌無(wú)菌發(fā)酵液為對(duì)照。

1.2.5 拮抗菌K5-4對(duì)冬棗采后黑斑病的防治效果測(cè)定 從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)成熟度和大小一致的果實(shí)，用2% NaClO浸泡2 min，再用自來(lái)水沖洗干凈，晾干。用滅菌打孔器在果實(shí)腰部打2個(gè)直徑5 mm、深5 mm的傷口。分別向果實(shí)傷口處接種濃度為1×108cfu/mL、1×107cfu/mL、1×106cfu/mL的拮抗菌懸液10 μL，以無(wú)菌水為對(duì)照，2 h后接種濃度為1×106cfu/mL的黑斑病菌孢子懸液10 μL。將果實(shí)放入400 mm×700 mm×280 mm塑料筐內(nèi)，筐口封保鮮膜保濕，25 ℃放置。7 d后測(cè)定果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑，每處理30個(gè)果實(shí)，3次重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.6 拮抗菌K5-4在冬棗果實(shí)中定殖能力測(cè)定 用移液槍分別吸取濃度為1×108cfu/mL拮抗菌懸液和濃度為1×106cfu/mL冬棗黑斑病菌孢子液10 μL接種于果實(shí)傷口內(nèi)，以只接種拮抗菌懸液的處理為對(duì)照。將接種拮抗菌的果實(shí)置于25 ℃下保濕貯藏，以接種后1 h測(cè)定的細(xì)菌數(shù)量為起始值，第12小時(shí)進(jìn)行第2次測(cè)定，以后每隔12 h測(cè)定一次，48 h后每隔24 h測(cè)定一次。測(cè)定方法為：用直徑為5 mm打孔器從傷口處取直徑5 mm、深 5 mm的果肉組織，放入無(wú)菌研缽中加10 mL的無(wú)菌生理鹽水(0.9% NaCl)研磨，勻漿后，用稀釋平板法計(jì)數(shù)。每個(gè)處理10個(gè)果實(shí)，3次重復(fù)。

1.2.7 拮抗菌K5-4的鑒定 拮抗菌的形態(tài)和生理生化特征測(cè)定：將K5-4菌株在LB培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d。依照Garrity等[10]的方法，對(duì)細(xì)菌分離物的菌落形態(tài)、菌體形態(tài)及生理生化性狀進(jìn)行測(cè)定。

菌株16S rDNA鑒定：利用細(xì)菌16S rRNA的高度保守性，對(duì)篩選到的拮抗細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定。引物為細(xì)菌16S rDNA的通用引物，Primer1：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；Primer2：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。以細(xì)菌單菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將條帶正確的PCR產(chǎn)物送上海生工基因有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序完成后，將得到的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST分析，選取具有代表性的菌株，采用MEGA 4.0軟件進(jìn)行多序列同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬棗黑斑病菌拮抗菌株的篩選

采用稀釋涂平板的方法從冬棗果實(shí)表面分離出細(xì)菌397株，平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，其中菌株K5-4對(duì)冬棗黑斑病菌的拮抗作用最好，抑菌帶寬度為10.06 mm(圖1)。

A.對(duì)照(無(wú)拮抗菌對(duì)峙)； B.K5-4對(duì)峙

2.2 拮抗菌K5-4對(duì)冬棗黑斑病菌的抑制機(jī)制

2.2.1 不同方式處理的拮抗菌K5-4發(fā)酵液對(duì)冬棗黑斑病菌的拮抗效果 不同處理的拮抗菌發(fā)酵液在平板上對(duì)冬棗黑斑病菌的抑菌效果不同(圖2)，其中K5-4發(fā)酵液、K5-4無(wú)菌水懸液以及無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)冬棗黑斑病菌均有較強(qiáng)的抑菌效果，抑菌帶寬度分別為10.2 mm、9.4 mm和10.0 mm。經(jīng)過(guò)121 ℃處理的K5-4無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)冬棗黑斑病菌的抑制作用則完全消失。說(shuō)明菌株K5-4能夠抑制冬棗黑斑病菌的生長(zhǎng)，其抑菌可能存在多種機(jī)制，包括營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和分泌抑菌活性物質(zhì)，而該物質(zhì)在高溫處理的情況下會(huì)失去抑菌活性。

1.K5-4發(fā)酵液(1×108 cfu/mL)； 2.K5-4無(wú)菌水懸液(1×108 cfu/mL)； 3.K5-4無(wú)菌發(fā)酵液(0.22 μm濾膜過(guò)濾)；4.熱處理的K5-4無(wú)菌發(fā)酵液(121 ℃，20 min)

2.2.2 拮抗菌K5-4無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)冬棗黑斑病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的影響 顯微觀察發(fā)現(xiàn)，K5-4對(duì)冬棗黑斑病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)具有明顯影響。在無(wú)拮抗菌發(fā)酵液的情況下，冬棗黑斑病菌孢子在8 h時(shí)開(kāi)始萌發(fā)，長(zhǎng)出芽管，之后伸長(zhǎng)成菌絲并形成菌絲團(tuán)，菌絲粗細(xì)均勻、生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)長(zhǎng)而均勻(圖3A)。用 K5-4無(wú)菌發(fā)酵液處理冬棗黑斑病菌，孢子能夠萌發(fā)，但萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)到16 h，芽管頂端異常膨大，菌絲生長(zhǎng)速度減緩(圖3B)。

A.對(duì)照(培養(yǎng)基)； B.K5-4發(fā)酵液

2.3 拮抗菌K5-4對(duì)冬棗黑斑病的防治作用

2.3.1 不同濃度拮抗菌對(duì)冬棗黑斑病的防治作用 由表1可知，與對(duì)照相比，3個(gè)濃度的拮抗菌處理均能降低冬棗黑斑病的發(fā)生，并能夠控制病斑的擴(kuò)展。其中濃度為1×108cfu/mL的拮抗菌K5-4發(fā)酵液對(duì)冬棗黑斑病發(fā)病率的抑制作用最為明顯，防病效果達(dá)到78.50%，比對(duì)照的病斑直徑小7.58 mm。濃度為1×107cfu/mL、1×106cfu/mL的K5-4發(fā)酵液也能夠顯著抑制冬棗黑斑病的發(fā)生，但防效略低于高濃度處理。

表1 不同濃度拮抗菌K5-4對(duì)冬棗黑斑病的防治效果

注：同列不同字母表示差異顯著(P≤0.05)。

2.3.2 拮抗菌K5-4在果實(shí)傷口的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài) K5-4在接種初期的48 h內(nèi)處于定殖和繁殖階段，前12 h內(nèi)迅速生長(zhǎng)，48 h時(shí)達(dá)到最高值，冬棗每個(gè)傷口內(nèi)的菌數(shù)為9.77×107cfu，是初始值的31.62倍。之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，拮抗菌的數(shù)量開(kāi)始下降，96 h后基本維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平(圖4)。由圖4還可以看出，接種K5-4發(fā)酵液的同時(shí)接種細(xì)交鏈格孢，拮抗菌在冬棗傷口的定殖情況與只接種K5-4處理基本相同，只是在后期K5-4的菌數(shù)略有降低。

圖4 拮抗菌K5-4在冬棗傷口的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)

2.4 拮抗菌K5-4的鑒定結(jié)果

2.4.1 拮抗菌K5-4菌落形態(tài)及生理生化特征 菌株 K5-4 在LB培養(yǎng)基上為淡黃色菌落，表面干燥且粗糙，邊緣不整齊。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，短桿狀、兩端鈍圓，單個(gè)、成對(duì)或成串出現(xiàn)；有芽孢，芽孢囊不膨大，芽孢橢圓形，中生到次端生。通過(guò)測(cè)定細(xì)菌K5-4的生理生化特征(表2)，初步確定K5-4菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

表2 K5-4的生理生化特征

注：+表示可生長(zhǎng)或陽(yáng)性反應(yīng)，-表示不可生長(zhǎng)或陰性反應(yīng)。

2.4.2 拮抗菌K5-4 的分子生物學(xué)鑒定 將拮抗菌K5-4 16S rDNA的測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)它與解淀粉芽孢桿菌有較高的同源性，并聚合在同一個(gè)分支(圖5)。結(jié)合K5-4菌落形態(tài)及生理生化特征，確定該菌株的分類(lèi)地位為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

圖5 K5-4的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論與討論

黑斑病是冬棗重要病害之一，對(duì)冬棗的產(chǎn)量及貯存危害較大，利用生物防治的方法既能有效防控病害發(fā)生又不造成農(nóng)藥殘留，是目前冬棗病害有效防治的研究熱點(diǎn)。已有利用枯草芽孢桿菌、成團(tuán)泛菌進(jìn)行冬棗采后黑斑病防治的相關(guān)研究，其中成團(tuán)泛菌B501的濃度為1×107cfu/mL時(shí)，對(duì)冬棗傷口黑斑病菌的抑制率達(dá)到80%以上[8]。耿海峰等[7]從土壤中篩選出11 株對(duì)冬棗細(xì)交鏈格孢病菌、多隔鐮孢霉和美澳核果褐腐串珠霉具有較好抑制作用的拮抗菌，其中枯草芽孢桿菌B26 的抑菌效果最為顯著，對(duì)冬棗采后黑斑病和爛果病防效顯著。

本研究前期進(jìn)行了河北省滄州、衡水、邯鄲、邢臺(tái)等地的罹病冬棗果實(shí)采集，并依據(jù)柯赫氏法則鑒定出河北省冬棗主要的黑斑病病原菌為細(xì)交鏈格孢，因此以該病原菌為靶標(biāo)，進(jìn)行了拮抗菌株的篩選。在拮抗菌的篩選過(guò)程中，首先用磷酸緩沖液對(duì)冬棗表面進(jìn)行了洗滌，之后用超聲波洗液進(jìn)行棗面定殖微生物的分離，以期能篩選出在冬棗上有良好定殖能力的菌株。通過(guò)平板對(duì)峙法篩選出1株能夠顯著抑制冬棗黑斑病菌生長(zhǎng)的菌株，其對(duì)冬棗黑斑病菌的抑菌帶寬度為10.06 mm。該菌的無(wú)菌發(fā)酵液也具有良好的抑菌活性，說(shuō)明K5-4能夠分泌抑制微生物生長(zhǎng)的活性物質(zhì)。利用不同濃度的K5-4菌株進(jìn)行冬棗黑斑病的活體防病試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌能夠有效地抑制冬棗黑斑病，而且其防病效果與濃度呈正比，在1×108cfu/mL、1×107cfu/mL和1×106cfu/mL 3個(gè)濃度下對(duì)冬棗黑斑病的防效分別為78.50%、61.23%、48.64%，說(shuō)明在中、高濃度下可以達(dá)到較好的生防效果。

本研究還測(cè)定了192 h內(nèi)K5-4在冬棗果實(shí)上的定殖能力，結(jié)果表明，K5-4能夠在冬棗內(nèi)定殖，在接種后的48 h內(nèi)拮抗菌迅速生長(zhǎng)繁殖，菌數(shù)增加為初始菌數(shù)的31.62倍，有無(wú)黑斑病病原菌存在對(duì)K5-4菌數(shù)基本無(wú)影響，說(shuō)明該菌具有良好的空間和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力，使其在合適的生態(tài)位迅速生長(zhǎng)繁殖，為其生防能力的發(fā)揮奠定基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，該拮抗菌株為解淀粉芽孢桿菌。有報(bào)道證明，解淀粉芽孢桿菌的一些菌株可以有效地抑制不同細(xì)菌、真菌引起的植物病害，并成為繼枯草芽孢桿菌之后應(yīng)用最多的一種拮抗微生物菌種，已有多種解淀粉芽孢桿菌的生防菌劑在生產(chǎn)上使用，并取得了良好的生防效果[11-12]。

通過(guò)該菌株在試驗(yàn)中的防治效果可以推測(cè)其在防治田間冬棗黑斑病和采后冬棗黑斑病中具有很好的應(yīng)用前景，值得深入研究。篩選和鑒定拮抗菌株只是冬棗黑斑病生物防治研究的一部分，拮抗菌最佳培養(yǎng)條件、活性物質(zhì)的理化性質(zhì)以及田間防效需要進(jìn)一步試驗(yàn)和研究。

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Screening and Control Effect Determination of Antagonistic Bacteria against Black Spot Disease of Jujube Fruit

SONG Cong1,HUANG Yali1*,XIE Chenxing1,2,JIA Zhenhua1,XU Wen1,2

(1.Institute of Biology,Hebei Academy of Sciences/Microbial Control Engineering Technology Center of Main Crops Disease in Hebei Province,Shijiazhuang 050081,China； 2.College of Chemical Engineering,Hebei University of Technology,Tianjin 300130,China)

To provide excellent biocontrol strain resources against Dongzao(ZiziphusjujubeMill.)black spot disease,with the pathogenAlternariaalternateas target,antagonistic microbial resources were screened from health jujube fruit.A total of 397 bacteria were isolated and purified from healthy jujube fruit surface using dilution method.Strain K5-4 had the most obvious effect with 10.06 mm inhibition zone.Its sterile broth had a good antibacterial activity also.Treatment with 1×108cfu/mL cell suspension of K5-4 could control the black spot disease on Dongzao of 78.50%.K5-4 could colonize in Dongzao fruit with or without the presence of black spot pathogen,and within 48 h after inoculation the number of K5-4 was 31.62 times the initial value.By morphological observation,physiological and biochemical characterization and the analysis of the 16S rDNA sequence,this strain was identified asBacillusamyloliquefaciens.The strain K5-4 has a good prospect in controlling black spot disease on jujube fruit.

ZiziphusjujubeMill.; black spot disease；Alternariaalternate; biocontrol；Bacillusamyloliquefaciens; control effect

2015-12-16

河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(15962904D)；河北省科技條件建設(shè)項(xiàng)目(15963203D)

宋 聰(1982-)，女，河北石家莊人，助理研究員，碩士，主要從事植物病害的生物防治研究。 E-mail：songcong1982@126.com

*通訊作者：黃亞麗(1975-)，女，河北肅寧人，副研究員，博士，主要從事植物病害的生物防治研究。 E-mail：huangyali2291@163.com

S436.65

A

1004-3268(2016)07-0071-05