蔣西然，章燕，秦紅梅，于寧，劉國(guó)杰，覃開(kāi)蓉，王曉晰

1.大連理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系，遼寧大連 116024；2.遼寧省衛(wèi)生計(jì)生委衛(wèi)生計(jì)生監(jiān)督局，遼寧 沈陽(yáng) 110005；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110032；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 公共基礎(chǔ)學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122

基于微流控芯片的環(huán)境衛(wèi)生檢驗(yàn)分析系統(tǒng)及裝置

蔣西然1，章燕2，秦紅梅2，于寧3，劉國(guó)杰4，覃開(kāi)蓉1，王曉晰4

1.大連理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系，遼寧大連 116024；2.遼寧省衛(wèi)生計(jì)生委衛(wèi)生計(jì)生監(jiān)督局，遼寧 沈陽(yáng) 110005；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110032；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 公共基礎(chǔ)學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122

近年來(lái)，微流控芯片在環(huán)境及醫(yī)學(xué)衛(wèi)生檢測(cè)分析領(lǐng)域發(fā)展迅速，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種實(shí)用性較強(qiáng)的芯片系統(tǒng)和設(shè)備。這些芯片裝置具有便攜性強(qiáng)和消耗低的特點(diǎn)，在一些領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用中已經(jīng)逐漸取代了常規(guī)技術(shù)方法。本文總結(jié)前人的研究成果，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)，闡述微流控芯片系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)和設(shè)備構(gòu)建的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景。

微流控芯片；環(huán)境衛(wèi)生檢驗(yàn)；便攜式設(shè)備；醫(yī)療設(shè)備

微流控芯片（Microfuidics，Lab on a Chip），也稱為微電動(dòng)機(jī)械系統(tǒng)（Micro Electromechanical System，MEMS）或微型全分析系統(tǒng)（Miniaturized Total Analysis Systems，uTAS），是以微型化、集成化和自動(dòng)化為技術(shù)特點(diǎn)，交叉集成了生物醫(yī)學(xué)、機(jī)械微加工和電子信息等多門(mén)學(xué)科技術(shù)，著眼于解決在極微小反應(yīng)體系（微升、納升或皮升）內(nèi)進(jìn)行的生物、化學(xué)等反應(yīng)分析過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)在宏觀實(shí)驗(yàn)條件下難以完成的科學(xué)任務(wù)[1]。微流控芯片技術(shù)自20世紀(jì)90年代初期誕生以來(lái)，已經(jīng)經(jīng)歷了二十多年的發(fā)展歷程，隨著彈性聚二甲基硅氧烷材料（Polydimethylsiloxane，PDMS）的普及使用和加工工藝的日益成熟，芯片的制作成本已經(jīng)降至較低水平，目前即使是在較為簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室條件下，也可以對(duì)較為精密的芯片結(jié)構(gòu)（約數(shù)十至數(shù)百微米精度）進(jìn)行加工制作[2]。在芯片內(nèi)薄層PDMS微閥門(mén)和微泵的作用下，可以在芯片內(nèi)部實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的操控。通過(guò)整合其它微型電器元件如傳感器探頭、薄片電阻、溫控薄膜和微型CCD等，能夠開(kāi)發(fā)出以微流控芯片為核心反應(yīng)單元的小型化檢驗(yàn)分析系統(tǒng)和設(shè)備[3]。目前，國(guó)內(nèi)外已有多家企業(yè)在進(jìn)行微流控芯片檢驗(yàn)分析裝置的開(kāi)發(fā)，有一些已經(jīng)走向市場(chǎng)進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用，具有微型便攜、低消耗低成本和自動(dòng)化程度高的優(yōu)勢(shì)，取得了良好的應(yīng)用效果?？梢灶A(yù)見(jiàn)在不遠(yuǎn)的將來(lái)，這些基于微流控芯片的新一代生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)分析裝置有望取代現(xiàn)有的常規(guī)儀器設(shè)備，尤其在便攜式檢驗(yàn)分析和個(gè)性化醫(yī)療領(lǐng)域?qū)l(fā)揮其巨大優(yōu)勢(shì)。本文結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的研究經(jīng)驗(yàn)和成果，對(duì)幾種微流控檢驗(yàn)分析系統(tǒng)的原理及應(yīng)用前景進(jìn)行闡述和探討。

1 PCR微流控芯片系統(tǒng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一項(xiàng)常規(guī)體外核酸分子檢驗(yàn)技術(shù)，最早于1986年由Mullis等[4]提出，具有操作簡(jiǎn)單、成本較低和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，在臨床醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測(cè)中應(yīng)用廣泛。PCR技術(shù)含有三個(gè)反應(yīng)步驟，即高溫解鏈、低溫退火和中溫延伸。在耐高溫聚合酶、引物和模板的共同作用下，能夠在短時(shí)間內(nèi)生成數(shù)十乃至數(shù)百萬(wàn)倍的核酸擴(kuò)增。常規(guī)的PCR熱循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)儀主要由精密溫控開(kāi)關(guān)和鍍金金屬孔板構(gòu)成，在儀器內(nèi)對(duì)金數(shù)孔板的溫度進(jìn)行精確操控，從而實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增所需的三個(gè)不同溫度循環(huán)。通常三溫度帶熱循環(huán)的次數(shù)約為25～35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)耗時(shí)約2～3 h[5]。

基于微流控芯片的PCR技術(shù)最早于2002年由Fakhari等人提出，主要包括兩種類型：靜態(tài)型和流動(dòng)型。靜態(tài)型是在芯片內(nèi)構(gòu)建一個(gè)反應(yīng)腔，將微縮后的PCR反應(yīng)體系注入到腔內(nèi)，再將芯片放置于加熱模塊上，周期性地進(jìn)行升溫、降溫，從而實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)所需的熱循環(huán)，常用半導(dǎo)體加熱片、聚酰亞胺加熱膜或氧化銦錫玻璃作為加熱器[6]。流動(dòng)型是指在芯片內(nèi)構(gòu)建一條或多條連通的微管道，將PCR反應(yīng)液體注入管道并在管道內(nèi)流動(dòng)，依次分別流經(jīng)高溫和低溫區(qū)，從而實(shí)現(xiàn)熱循環(huán)[7]。圖1為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的一塊流動(dòng)型PCR擴(kuò)增芯片，芯片以PDMS和玻璃為制材，管道寬度250 μm，灌注藍(lán)色染料作為標(biāo)識(shí)。該P(yáng)CR芯片為一次性使用，可以實(shí)現(xiàn)25～30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，總反應(yīng)時(shí)間只需30～40 min。

圖1 流動(dòng)型PCR微流控芯片

由于靜態(tài)型PCR芯片受限于反應(yīng)腔室的固定體積，不利于根據(jù)需要增減反應(yīng)體系的總量，因此近年針對(duì)流動(dòng)式PCR芯片的研究較多。在流動(dòng)型PCR芯片內(nèi)，反應(yīng)液是連續(xù)不斷流動(dòng)的，熱傳導(dǎo)效率更高，按照流動(dòng)狀態(tài)的不同又可分為循環(huán)流動(dòng)型和連續(xù)流動(dòng)型芯片。圖2為連續(xù)流動(dòng)型PCR芯片裝置[8]。整套系統(tǒng)尺寸約10 cm×10 cm×5 cm，重量約300 g，可以由電池供電，適用于便攜式臨床檢驗(yàn)或環(huán)境微生物的現(xiàn)場(chǎng)分析。

圖2 一種連續(xù)流動(dòng)型PCR芯片系統(tǒng)[8]

PCR微流控芯片系統(tǒng)的主要優(yōu)勢(shì)有：① 微流控芯片內(nèi)的微通道尺寸通常在微米級(jí)別，具有比表面積大的特點(diǎn)（比常規(guī)的反應(yīng)管的比表面積大10～20倍左右），熱傳導(dǎo)效率更高，芯片內(nèi)升溫和降溫都較快，可大幅縮短反應(yīng)分析所需的時(shí)間；② 微流控芯片內(nèi)的反應(yīng)體系可以等比例縮小數(shù)十乃至數(shù)百倍，可達(dá)到納升或皮升級(jí)別，可大幅降低成本；③ 以微流控芯片為核心反應(yīng)單元，與其它外圍設(shè)備（例如針對(duì)熒光實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析的熒光激發(fā)和檢測(cè)探頭等）相整合，可以將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接作為模板直接進(jìn)入后續(xù)分析反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)反應(yīng)和分析過(guò)程的集成化[9]。目前，國(guó)內(nèi)幾家企業(yè)已經(jīng)生產(chǎn)出實(shí)用性很強(qiáng)的芯片PCR設(shè)備，可以針對(duì)常見(jiàn)的致病微生物進(jìn)行快速檢驗(yàn)。這些芯片大多采用PMMA或PC作為制作材料，成本較低，配套有微型加熱薄膜和光學(xué)檢測(cè)儀等外圍設(shè)備，成熟度較高。

2 LAMP微流控芯片系統(tǒng)

LAMP技術(shù)最早于本世紀(jì)初由日本學(xué)者提出，是一種恒溫條件下的核酸擴(kuò)增技術(shù)。在4～6條引物及Bst聚合酶的作用下，可以在恒溫（約60～65℃）條件進(jìn)行延伸擴(kuò)增。LAMP技術(shù)的化學(xué)反應(yīng)耗時(shí)較短，檢驗(yàn)靈敏度較高，因此近年來(lái)得到了很多研究者的關(guān)注[10]。國(guó)內(nèi)多家企業(yè)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了基于微流控芯片的LAMP分析設(shè)備。圖3為一種半開(kāi)放式LAMP擴(kuò)增微流控芯片系統(tǒng)，可以一次針對(duì)四種樣品進(jìn)行并行檢驗(yàn)分析[11]。

圖3 一種LAMP微流控芯片系統(tǒng)[11]

LAMP擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物量極大（比PCR反應(yīng)高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)），這些大量產(chǎn)生的核酸片段容易導(dǎo)致空氣氣溶膠污染，從而造成假陽(yáng)性分析結(jié)果。因此，對(duì)于LAMP分析設(shè)備而言，系統(tǒng)的密閉性十分必要，需要避免LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物離開(kāi)芯片擴(kuò)散到空氣中。為此，本實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)發(fā)了一種封閉性較好的雙層微流控芯片，見(jiàn)圖4。該芯片系統(tǒng)采用PDMS為制作材料，以礦物油對(duì)芯片管道的進(jìn)液和出液孔進(jìn)行封閉，能夠一次針對(duì)五中樣本進(jìn)行高通量分析。

在外圍控制系統(tǒng)方面，主要采用微量進(jìn)液蠕動(dòng)泵，通過(guò)塑料管和針頭連接與芯片的管道，用以對(duì)芯片內(nèi)的流體進(jìn)行操控。反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)通過(guò)CCD采集卡實(shí)時(shí)獲取并傳輸?shù)诫娔X中進(jìn)行分析。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)的北京博奧公司已經(jīng)開(kāi)發(fā)出便攜式LAMP微流控檢驗(yàn)設(shè)備，配套有旋轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)裝置，采用旋轉(zhuǎn)離心力作為芯片液體的驅(qū)動(dòng)動(dòng)力。同時(shí)內(nèi)置光學(xué)探頭，可以對(duì)LAMP反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)采集。

圖4 一種密閉性良好的LAMP微流控芯片

3 核酸微陣列微流控芯片系統(tǒng)

核酸微陣列雜交是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和環(huán)境衛(wèi)生檢驗(yàn)領(lǐng)域中常用的一種高通量分析技術(shù)，可以對(duì)樣本中的核酸分子進(jìn)行快速捕獲和判斷，但常規(guī)微陣列設(shè)備價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，不利于大范圍普及應(yīng)用[12]。本課題組前期開(kāi)發(fā)了基于微流控芯片的小型化核酸微陣列雜交設(shè)備，具有便攜性強(qiáng)，成本低廉的優(yōu)勢(shì)。圖5所示為本課題組開(kāi)發(fā)的靜態(tài)微陣列雜交芯片系統(tǒng)[8]。該系統(tǒng)為一次性使用，成本低廉，可以一次針對(duì)六種不同的靶標(biāo)物進(jìn)行高通量檢驗(yàn)分析。

圖5 一種靜態(tài)核酸雜交芯片系統(tǒng)[8]

核酸微陣列微流控芯片設(shè)備的主要優(yōu)勢(shì)在于通量高，采用超高密度集成的設(shè)計(jì)方案，可以在數(shù)平方厘米的載體表面固定數(shù)百個(gè)核酸探針，能一次針對(duì)數(shù)十或數(shù)百種靶標(biāo)物進(jìn)行分析[13]。但是，目前對(duì)該類檢驗(yàn)分析設(shè)備的開(kāi)發(fā)較少，主要原因是雜交分析的結(jié)果讀取需要精度較高的熒光激發(fā)和采集系統(tǒng)，而搭建這一系統(tǒng)的成本較高[14]。此外，靜態(tài)雜交反應(yīng)依賴被動(dòng)分子擴(kuò)散，耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，當(dāng)前最新的微陣列雜交系統(tǒng)是采用流動(dòng)式雜交的方式，可以進(jìn)一步縮短分析所需的時(shí)間[15]。

4 免疫分析微流控芯片系統(tǒng)

基于微流控芯片的的免疫檢驗(yàn)分析技術(shù)的基本原理是將常規(guī)免疫反應(yīng)體系按照一定的比例縮小，使其適合芯片內(nèi)的管道和反應(yīng)腔室的容積，同時(shí)，在芯片內(nèi)構(gòu)建半透閥結(jié)構(gòu)，將抗體固定在微珠表面，在芯片內(nèi)的微免疫柱內(nèi)完成免疫分析[16]。免疫微流控芯片的優(yōu)勢(shì)主要有：試劑消耗量低、反應(yīng)速度快、分析精度高和反應(yīng)通量高。圖6所示為本課題組構(gòu)建的一種免疫微流控芯片系統(tǒng)[17]。

灌注在芯片微反應(yīng)柱內(nèi)的微珠表面事先固定有特異性抗體，可以對(duì)流經(jīng)反應(yīng)柱的樣品中的特異性靶標(biāo)物進(jìn)行結(jié)合和捕獲。而后，在帶有熒光標(biāo)記的二抗作用下顯色，結(jié)果可由微型CCD采集到計(jì)算機(jī)中進(jìn)行亮度分析，從而對(duì)樣品中靶標(biāo)物的含量進(jìn)行初步判斷。這種免疫微流控芯片系統(tǒng)已應(yīng)用于檢測(cè)環(huán)境水體中的瘧原蟲(chóng)，與常規(guī)檢測(cè)系統(tǒng)相比，具有更高的穩(wěn)定性和檢測(cè)靈敏度[17]。

圖6 含有微免疫分析柱的微流控芯片系統(tǒng)[17]

5 展望

微流控芯片技術(shù)自誕生以來(lái)一直到世界各國(guó)研究者的廣泛關(guān)注。2010年之前，大部分研究者都處于基礎(chǔ)研究階段，即對(duì)微流控芯片的制造、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行不斷改進(jìn)、完善。近年，已經(jīng)有多種實(shí)用性較強(qiáng)的微流控芯片檢驗(yàn)分析設(shè)備相繼問(wèn)世，進(jìn)入醫(yī)院臨床、環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測(cè)等實(shí)際應(yīng)用中，取得了良好效果。我國(guó)在此領(lǐng)域起步較早，研究水平處于世界前列，但距離開(kāi)發(fā)出成熟穩(wěn)定的微流控檢驗(yàn)分析設(shè)備還有一定的距離。隨著個(gè)性化醫(yī)療和現(xiàn)場(chǎng)快檢的需求日益增加，微流控芯片作為檢驗(yàn)分析的核心反應(yīng)單元，有望在不遠(yuǎn)的將來(lái)大量取代現(xiàn)有的常規(guī)儀器系統(tǒng)，有助于實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)分析設(shè)備的微型便攜、低消耗和高通量。

[1]Whitesides GM.The origins and the future of microfuidics[J].Nature,2006,442:368-373.

[2]蔣西然,李靈,于寧,等.微流控芯片快速檢測(cè)空氣氣流中金黃葡萄球菌的研究[J].水動(dòng)力學(xué)研究與進(jìn)展,2015,30(6):619-623.

[3]Lilehoj PB,Huang MC,Truong N,et al.Rapid electrochemical detection on a mobile phone[J].Lab Chip,2013,13(15):2950-2955.

[4]Mullis K,Faloona F,Scharf S,et al.Specific enzymatic amplification of DNA in vitro:the polymerase chain reaction[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol,1986,51 Pt 1:263-273.

[5]Mo XT,Zhou YP,Lei H,et al.Microbalance DNA probe method for the detection of specifc bacteria in water[J].Enzyme Microb Tech,2002,30(5):583-589.

[6]Hoffmann J,Trotter M,von Stetten F,et al.Solid-phase PCR in a picowell array for immobilizing and arraying 100,000 PCR products to a microscope slide[J].Lab Chip,2012,12(17):3049-3054.

[7]Kricka LJ,Wilding P.Microchip PCR[J].Anal Bioanal Chem,2003,377:820-825.

[8]Jiang X,Shao N,Jing W,et al.Microfuidic chip integrating high throughput continuous-flow PCR and DNA hybridization for bacteria analysis[J].Talanta,2014,122:246-250.

[9]Jiang X,Jing W,Zheng L,et al.A Continuous-flow highthroughput microfluidic device for airborne bacteria PCR detection[J].Lab Chip,2014,14:671-676.

[10]Fang X,Chen H,Xu L,et al.A portable and integrated nucleic acid amplifcation microfuidic chip for identifying bacteria[J].Lab Chip,2012,12,1495-1499

[11]Yuan H,Liu YC,Jiang XR,et al.Microfluidic chip for rapid analysis of cerebrospinal fluid infected with Staphylococcus aureus[J].Anal Methods,2014,6:2015-2019.

[12]Zheng L,Fu Y,Jiang X,et al.Microfluidic system for highthroughput immunoglobulin-E analysis from clinical serum samples[J].Talanta,2015,143:83-89.

[13]靳連群,李君文,王升啟,等.基因芯片技術(shù)檢測(cè)環(huán)境中常見(jiàn)致病菌的初步研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2003,23(1):74-78.

[14]Peytavi R,Raymond FR,Gagné D,et al.Microfuidic device for rapid (＜15 min) automated microarray hybridization[J].Clin Chem,2005,51(10):1836-1844.

[15]Wang L,Li PC.Optimization of a microfluidic microarray device for the fast discrimination of fungal pathogenic DNA[J].Anal Biochem,2010,400(2):282-288.

[16]Jing W,Jiang X,Zhao W,et al.Microfluidic platform for direct capture and analysis of airborne Mycobacterium tuberculosis[J].Anal Chem,2014,86(12):5815-5821.

[17]Zhao W,Zhang L,Jing W,et al.An integrated microfuidic device for rapid serodiagnosis of amebiasis[J].Biomicrofuidics,2013,7(1):011101.

Microfuidics-Based Environmental Health Assessment System &Device

Microfuidic technique is developing rapidly in the felds of environmental health assessment and clinical identifcation. Many practicable and robust chip systems and devices have been developed in the past few years. The chip-based devices have various advantages such as portability and low consumption,which makes them practical and partly replaced the traditional techniques. In this study,research progress on microfuidic-based devices has been summarized. The development of microfuidic systems and the construction methods have been introduced and discussed based on our previous works.

microfuidics;environmental health assessment;portable devices;medical devices

JIANG Xi-ran1,ZHANG Yan2,QIN Hong-mei2,YU Ning3,LIU Guo-jie4,QIN Kai-rong1,WANG Xiao-xi4

1. Department of Biomedical Engineering,Dalian University of Technology,Dalian Liaoning 116024,China;2. Liaoning Health and Family Planning Inspection,Shenyang Liaoning 110005,China;3. The First Clinical College,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang Liaoning 110032,China;4. Sports Teaching and Research Room,College of Public Foundation,China Medical University Shenyang Liaoning 110122,China

R318.6;TN409

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2016.09.002

1674-1633(2016)09-0005-04

2016-08-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81501833）；遼寧省自然科學(xué)基金（2015020574）。

本文作者：蔣西然，講師，博士，研究方向：微流控芯片。

王曉晰，技師。

通訊作者郵箱：xiaoxiwang@cmu.edu.cn