孫明，李巖，劉巧榮，張魯安，喬明明，李靜，鄧小雨，馮向輝，劉伯華，陳西釗*

(1. 北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司，北京 100094；2. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團畜牧獸醫(yī)工作總站，烏魯木齊 830063)

牛副流感病毒3型毒株的分離鑒定及基因組遺傳變異分析

孫明1，李巖2，劉巧榮1，張魯安2，喬明明1，李靜2，鄧小雨1，馮向輝1，劉伯華1，陳西釗1*

(1. 北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司，北京 100094；2. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團畜牧獸醫(yī)工作總站，烏魯木齊 830063)

從新疆地區(qū)某牛場出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽等癥狀的多例病牛的肺組織中分離得到3株牛副流感病毒3型，分別命名為XJ03、XJ022、XJ023，對其中兩株病毒XJ03和XJ023的基因組進行序列測定，測序結(jié)果顯示，XJ03和XJ023毒株基因組全長分別為15474 bp(GenBank登錄號為KU198929)和15475 bp，其核苷酸同源性為99.89%。同代表性的牛副流感病毒基因組比對發(fā)現(xiàn)，與我國的山東毒株SD0835同源性最高為99.3%，均屬C型BPIV。在C型毒株中，與南韓12Q061分離株(C型)同源性最低為97.5%。F、N、HN、L、P、M蛋白基因氨基酸序列分析顯示，與SD0835毒株相應(yīng)序列對比，同源性分別為99.63%、92.15% 、99.48%、99.28%、98.50%和100%，部分氨基酸發(fā)生了新的變異。試驗結(jié)果將為今后更好地開展BPIV3防控奠定基礎(chǔ)。

牛副流感病毒；分離鑒定；基因組分析

牛副流感病毒3型(Bovine Parainfluenza virus type 3, BPIV3)為單股負(fù)鏈RNA病毒目、副黏病毒科、呼吸道病毒屬成員，是引起牛呼吸道疾病綜合征的重要病原之一[1-2]。1959年Reisinger等在美國首次分離到BPIV3[3]，2002年童澤恩等在國內(nèi)首次報道了疑似該病的病例[4]。目前該病毒已廣泛存在于世界各國。BPIV3感染牛可表現(xiàn)出從隱性感染到嚴(yán)重的呼吸道疾病等多種不同的臨床癥狀，最常見的為咳嗽、發(fā)燒、鼻分泌物多。牛感染BPIV3后可引起組織損傷和免疫抑制，常繼發(fā)細(xì)菌或支原體感染引起支氣管肺炎而導(dǎo)致牛呼吸道疾病綜合征，給養(yǎng)牛業(yè)帶來嚴(yán)重危害和極大的經(jīng)濟損失。

BPIV3可分為A、B、C三個基因型，在亞洲、澳大利亞、阿根廷、美國等國家或地區(qū)均同時存在2個或3個基因型[5-8]。我國也從黑龍江和山東分別分離到A型和C型BPIV3[9-10]。王海勇等[11]對我國12個省份的牛群進行了BPIV3的血清學(xué)調(diào)查，總體陽性率高達77.6%，表明BPIV3在我國已廣泛流行，迫切需求對該病毒進行深入研究以有效防控BPIV3感染。

2014年10月，新疆某牛場的牛群內(nèi)出現(xiàn)咳嗽、發(fā)燒癥狀，初步懷疑為BPIV3感染，并分離獲得三株BPIV3。為進一步分析我國西北地區(qū)流行的BPIV的基因特征和變異特征，本研究對該分離株進行鑒定和全基因組測序，并與國內(nèi)外代表性毒株基因組序列對比分析，以期為該病的流行病學(xué)、免疫預(yù)防等方面的研究提供相關(guān)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 采集三頭疑似BPIV3感染病牛肺作為病毒分離的病料，編號為03、022、023。

1.1.2 細(xì)胞和培養(yǎng)基 牛腎細(xì)胞(MDBK)為本實驗室保存；DMEM購自GIBCO公司；胎牛血清購自新西蘭MOREGATE。1.1.3 主要試劑和儀器 RNA提取試劑購自Qiagen公司；AMV Reverse Transcriptase、RNase inhibitor、GoTaq DNA Polymerase購自Promega公司；dNTP購自北京華美生科生物技術(shù)有限公司；Trans 2K DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TGRANDIENT PCR儀購自HYBAID公司；UVI Firereader XS 凝膠成像系統(tǒng)購自廣州市華粵瑞科科學(xué)器材有限公司。牛副流感實時熒光RT-PCR檢測試劑盒為北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 軟件信息 DNAMAN 6.0 漢化版，美國Lynnon Biosoft公司開發(fā)。

1.2 方法1.2.1 病料的處理 將采集的三份牛肺分別剪碎裝入無菌研磨器中研磨，加適量含青霉素、鏈霉素(各100 U/mL)的DMEM培養(yǎng)液，研磨后于3000 r/min離心10 min，取上清用0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.2.2 病毒分離培養(yǎng) 用含8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MDBK細(xì)胞，待細(xì)胞長至單層處于對數(shù)生長期時，接種上述處理的病料樣品，37 ℃吸附1 h，加入含2%胎牛血清的維持液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)，適時傳代至出現(xiàn)CPE，當(dāng)80%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時收毒，-80 ℃反復(fù)凍融3次后，4000 r/min離心15 min，取上清待檢。

1.2.3 病毒鑒定

1.2.3.1 RT-PCR鑒定 按照北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)的牛副流感實時熒光RT-PCR檢測試劑盒說明書對MDBK細(xì)胞培養(yǎng)物進行鑒定。

1.2.3.2 電鏡觀察 參考文獻方法[12]對細(xì)胞培養(yǎng)液進行負(fù)染，進行電鏡觀察。

1.2.3.3 TCID50測定 將收獲的第5代病毒上清液用不含血清的DMEM培養(yǎng)基進行稀釋，每個稀釋度做8個重復(fù)，每孔接種100 μL，37 ℃孵育2 h。吸取病毒液，用PBS洗一遍，每孔加200 μL細(xì)胞維持液繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察記錄CPE，5 d后判定結(jié)果，同時設(shè)陰性對照(維持液)。

1.2.3.4 血凝試驗 參考文獻方法[12]進行。

1.2.4 全基因組測序與分析

1.2.4.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的BPIV3全基因組序列設(shè)計引物(表1)，引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成。

表1 依據(jù)BPIV3基因序列設(shè)計的引物

1.2.4.2 病毒總RNA的提取 按照Qiagen的RNA提取試劑盒說明書進行RNA提取。

1.2.4.3 全基因組的擴增 用合成的13對引物分別進行RT-PCR擴增，擴增體系如下：5×Buffer 5 μL(含MgCl2)，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L上游和下游引物2 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)1 μL， AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/μL)0.2 μL，RNA酶抑制劑(40 U/μL)0.3 μL，無菌無核酸酶水12.5 μL，病毒總RNA 2 μL。擴增程序：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.4.4 基因的測序 從瓊脂糖凝膠中回收目的基因，將目的基因連接到PMD19-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜，取菌液進行PCR鑒定，將陽性菌液送北京美吉生物技術(shù)有限公司進行測序。根據(jù)重疊區(qū)域?qū)⒏髌我来纹唇樱@得完整基因序列。

1.2.4.5 系統(tǒng)進化分析 用DNAman生物軟件將獲得的全基因組序列與GenBank上發(fā)表的BPIV3序列進行同源性比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析所分離毒株的遺傳變異特征。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離 將03、022、023分別接種MDBK，72 h后出現(xiàn)CPE，經(jīng)傳代以后出現(xiàn)CPE的時間縮短，從第3代開始病毒趨于穩(wěn)定。病變初期細(xì)胞出現(xiàn)圓縮，隨時間延長細(xì)胞融合更加明顯，出現(xiàn)合胞體(圖1A)。對照組細(xì)胞培養(yǎng)72h后生長良好，未見細(xì)胞發(fā)生病變(圖1B)。將分離的病毒分別命名為XJ03、XJ022、XJ023。

A：接毒后72 h XJ03株感染引起的CPE；B：陰性對照圖1 牛副流感病毒分離培養(yǎng)顯微觀察圖(400×)

2.2 病毒鑒定

2.2.1 RT-PCR鑒定 用牛副流感實時熒光RT-PCR檢測試劑盒分別對XJ02、XJ022、XJ023進行鑒定，結(jié)果為陽性(圖2)，表明分離的三個病毒均為BPIV3。

1: XJ023；2: XJ03；3: XJ022；4:陽性對照；5:陰性對照圖2 XJ02、XJ022、XJ023牛副流感病毒實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果

2.2.2 電鏡觀察 圖3電鏡照片顯示，BPIV為圓形、橢圓形等不規(guī)則形態(tài)，有核衣殼，直徑約為150～200 nm。

圖3 電鏡下不同形態(tài)的牛副流感病毒粒子(100000×)

2.2.3 TCID50測定 按照Reed-Muench計算法進行計算，第5代細(xì)胞毒(XJ03毒株)的病毒含量為107.0TCID50/mL。

2.2.4 血凝試驗 分離的牛副流感病毒能凝集雞和豬的紅細(xì)胞，XJ03、XJ022、XJ023三株病毒的凝集效價分別達到32和128。

2.3 基因的測序及序列分析 經(jīng)測序，XJ03和XJ023的基因組全長分別為15474 bp和15475 bp，應(yīng)用DNAstar將其與有代表性的BPIV3進行同源性比較，結(jié)果見圖4，分離的兩株BPIV3均與12Q061、HS9、TVMDL16同源性較高，與我國的山東毒株SD0835同源性最高，為99.3%。以M基因進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果見圖5，分離的XJ03和XJ023均與SD0835處于同一分支，屬C型BPIV3。XJ03分離株與SD0835毒株相比，F(xiàn)、N、HN、L、P和M氨基酸同源性分別為99.63%、92.15%、99.48%、99.28%、98.50%和100%。

圖4 XJ03和XJ023與其他毒株全基因的同源性比較

圖5 XJ03和XJ023與其他BPIV3代表株的M基因系統(tǒng)進化分析

與SD0835分離株相比，F(xiàn)氨基酸有2處發(fā)生了變異，分別為第10位由T變成了I、第522位由S變成了R；HN基因有3處發(fā)生了變異，分別是46位由T變成了A，59位由G變成了S，254位由K變成了R；N基因有8處發(fā)生了變異，分別是16位由L變成了I，113位由S變成了G，194位由Q變成了R，220位由A變成了S，402位由I變成了S，452位由V變成了A，465位由N變成了D；P基因有9處發(fā)生了變異，分別是45位由V變成了A，47位由D變成了V，53位由G變成了E，149位由T變成A，227位由Y變成了H，245位由E變成了D，322位由Y變成了H，329位由L變成了V，339位由I變成了V。

3 討論

BPIV3是牛呼吸道綜合癥(也常稱為“運輸熱”)的主要病原之一，也是引起奶牛繁殖障礙的重要病原，是目前全世界范圍內(nèi)危害牛群健康的主要問題，并給養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。本研究采用MDBK細(xì)胞從新疆某牛場出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽和流產(chǎn)的病牛肺組織中分離出3株牛副流感病毒。經(jīng)鑒定該分離株能凝集雞和豬的紅細(xì)胞，與董秀梅報道的一致[13]。基因組測序結(jié)果顯示，XJ03和XJ023的基因全長分別為15474 bp和15475 bp，XJ03基因組序列已經(jīng)提交到GenBank，登錄序列號為KU198929。

BPIV3分A、B、C三個基因型，A型BPIV3主要存在于北美、中國、日本。B型BPIV3最初分離自澳大利亞，最近在美國、阿根廷也發(fā)現(xiàn)B型毒株；C型BPIV3分布于中國、韓國、日本。之前認(rèn)為美國只存在A型BPIV3，John D. Neill等通過對多個BPIV3美國分離株的全基因測序及系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，美國也同樣存在B型和C型BPIV3。通過全基因測序和系統(tǒng)進化分析，本研究從新疆牛場分離到的XJ03和XJ023均為C型BPIV3，與我國山東分離株SD0835同源性為99.3%，系統(tǒng)進化分析也表明所分離毒株與SD0835分離株最近。與SD0835分離株相比，除M 蛋白外，F(xiàn)、HN、N、P和L蛋白氨基酸均發(fā)生了新的變異，這些變異是否影響病毒毒力還需進一步研究。

John D. Neill認(rèn)為各基因型內(nèi)存在潛在的亞型，并推測亞型與毒株的地域分布相關(guān)[14]。經(jīng)系統(tǒng)進化分析，本研究分離的XJ03和XJ023與山東分離株SD0835形成一單獨分支，與韓國分離株12Q061、美國分離株TVMD16等其它C型BPIV3遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，這與John D. Neill的觀點相符。目前還沒有證據(jù)表明不同基因型對牛的致病力是否存在差異。但不同基因型的交叉保護效果存在明顯差異，如BPIV3 NVSL株的多抗血清對B型和C型BPIV3的中和效價要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對A型BPIV3代表毒株SF-4的中和效價[14]；使用單一基因型的疫苗可能達不到理想的保護效果。因此，防控BPIV3的傳播還需要多價疫苗的開發(fā)。

本研究分離鑒定了三株C型BPIV3，并對其中兩株進行了全基因測定，為其在診斷和疫苗開發(fā)等方面的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯：李文平)

Isolation, Identification and Genomic Characterization of Bovine Parainfluenza Viruses Type 3

SUN Ming1, LI Yan2, LIU Qiao-rong1, ZHANG Lu-an2, QIAO Ming-ming1, LI Jing2,DENG Xiao-yu1, FENG Xiang-hui1, LIU Bo-hua1, CHEN Xi-zhao1*

(1．BeijingAnhealLaboratoriesCo.,Ltd,Beijing100094,China;2.XinjiangProductionAndConstructionCorps,AnimalHusbandryandVeterinaryWorkStation,Urumqi, 830063,China)

Three strains of bovine parainfluenza viruses type 3(BPIV3) were successfully isolated from lung tissues of sick cattle with symptom of fever and cough emerged at a farm in Xinjiang region, and further identified by SYBR green RT-PCR. Their genome sequences were characterized. Three isolates of BPIV3 in total were obtained and designated as XJ03, XJ022 and XJ023 respectively. Genomic characterization of the two isolate XJ03 and XJ023 showed their whole genome lengths were 15475 bp and 15477 bp respectively, and were phylogenetically most closely related to the BPIV SD0835, with 99.3% identity at nucleotide, they all belong to BIPV3 genotype C. Among isolates of BIPV3 genotype C, the isolates XJ03 and XJ023 exhibited the lowest nucleotide similarity with South Korean 12Q061 strain (97.5%). In comparison to strains SD0835, the F, N, HN, L, P and M protein of isolate XJ03 have 99.63%, 92.15%, 99.48%, 99.28%, 98.50% and 100% amino acid sequence identity to those of SD0835, respectively, and there exist several new amino acid mutations. These results would be helpful for the diagnosis and control of BPIV3.

bovine parainfluenza virus; isolation and identification; genomic characterization

孫明，博士，從事分子病毒學(xué)診斷技術(shù)研究。

2016-06-28

A

1002-1280 (2016) 11-0017-05

S852.65