齊冬梅，徐蕙，易婷，王漢清，胡文軍，張震，林旭埜*

(1.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣州 511356；2.廣州市黃埔軍校紀念中學，廣州 510770)

烏鱧舒氏氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗

齊冬梅1，徐蕙1，易婷2，王漢清1，胡文軍1，張震1，林旭埜1*

(1.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣州 511356；2.廣州市黃埔軍校紀念中學，廣州 510770)

對廣東省佛山市某烏鱧養(yǎng)殖魚場患病的烏鱧進行病原分離，將疑似分離菌S-1株進行形態(tài)和培養(yǎng)特性、生化特性鑒定、PCR鑒定、藥敏試驗和人工感染等試驗。結(jié)果表明，該分離菌為舒氏氣單胞菌。藥敏試驗結(jié)果表明，本分離菌對壯觀霉素、米諾環(huán)素、慶大霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢類等多種藥物敏感。本研究為舒氏氣單胞菌病細菌學檢測及治療提供了科學依據(jù)。

烏鱧；舒氏氣單胞菌；分離鑒定；藥敏試驗

烏鱧別名生魚、黑魚，是一種肉食性兇猛魚類，主要以魚、蝦等為食。近年來隨著烏鱧人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，該魚的多種疾病也隨之出現(xiàn)[1]。2014年9月佛山某烏鱧養(yǎng)殖魚場出現(xiàn)的大量烏鱧發(fā)病和死亡病例，病魚表現(xiàn)為皮表潰爛，肝、腎和脾臟有不同程度白色病灶。對病魚和瀕死魚進行細菌病原分離鑒定。成功分離到1株革蘭氏陰性菌，并對該分離菌進行了培養(yǎng)特性、PCR鑒定、生化鑒定、藥敏試驗和本動物回歸試驗，為研究舒氏氣單胞菌的致病機理及建立病原學和免疫學診斷技術(shù)提供科學依據(jù)，并為臨床治療提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 廣東省佛山市某烏鱧養(yǎng)殖魚場病魚和瀕死魚。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、鮮血瓊脂平板、革蘭氏染色液等購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；生化試劑、藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技北京有限公司；16S rRNA通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 健康烏鱧 購自佛山市南海鎮(zhèn)九江區(qū)烏鱧養(yǎng)殖基地。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 無菌取發(fā)病和瀕死烏鱧的肝臟和腎臟，分別劃線接種于TSA和鮮血瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落生長情況。挑選典型菌落多次純培養(yǎng)后進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細菌形態(tài)特征。1.2.2 生化鑒定 根據(jù)分離菌的培養(yǎng)特性、染色特性，選擇葡萄糖、麥芽糖、果糖、木糖、乳糖、鼠李糖、蔗糖、甘露醇、七葉苷、H2S、液化明膠、H2O2、氧化酶、硝酸鹽還原試驗等按照常規(guī)方法進行生化鑒定[2]。

1.2.3 藥敏試驗 藥敏試驗采用WHO推薦的Kirby-Bauer紙片擴散法，分離菌株對近20種常用抗菌藥物的敏感性進行檢測，將檢測平板置28 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，按美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)的標準判定為敏感、中度敏感和耐藥[3]。1.2.4 16S rRNA基因擴增 取菌液按基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，以其為模板利用16S rRNA通用引物進行基因擴增。上游引物P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAB-3’；下游引物P2：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

50 μL反應體系：ddH2O 38.5 μL、10×Taq reaction buffer(Mg2+plus)5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)4 μL、上下游引物各1 μL、模板0.25 μL、Taq酶 0.25 μL；擴增條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察結(jié)果。擴增產(chǎn)物純化后與pMDT-19載體連接，提取質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.5 動物回歸試驗 將分離菌株接種TSB肉湯，28 ℃培養(yǎng)24 h后，平板計數(shù)法測定菌液濃度。用無菌生理鹽水稀釋并調(diào)整菌液濃度為：3.8×109、7.6×108CFU/mL。100～150 g健康烏鱧150尾隨機分成3組，每組50尾。兩個試驗組分別腹腔注射菌液0.1 mL/尾，對照組注射TSB肉湯0.1 mL/尾。攻毒后觀察和記錄試驗魚的死亡情況，并對死亡魚進行剖解和病原菌的分離，分離菌進行革蘭氏染色及16S rRNA PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)觀察結(jié)果 分離菌經(jīng)革蘭氏染色鏡檢可見革蘭氏陰性，兩端鈍圓小桿菌，多單個散在，無芽胞和莢膜(圖1)。普通營養(yǎng)瓊脂平板上菌落為光滑、灰白色、半透明、隆起、邊緣整齊、濕潤、圓形的中等大小菌落。將分離株命名為S-1。

圖1 S-1株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(1000×)

2.2 生化鑒定結(jié)果 S-1株分離菌可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、果糖；不發(fā)酵木糖、乳糖、鼠李糖、蔗糖、甘露醇、七葉苷，H2S、液化明膠、H2O2、氧化酶均為陰性反應；硝酸鹽還原試驗為陽性反應，與《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》[2]對此菌的描述相符，詳細結(jié)果見下表1所示。

表1 分離株S-1生化鑒定結(jié)果表

“+”為陽性，“-”為陰性

2.3 藥敏試驗結(jié)果 選擇近20種抗菌藥物做藥物敏感性試驗，結(jié)果顯示分離菌S-1株對卡那霉素、四環(huán)素、克拉霉素、紅霉素、妥布霉素耐藥，對其他受試藥物有著不同程度的敏感性，對多數(shù)受試藥物具有較高的敏感性，具體結(jié)果詳見表2。

表2 分離株S-1藥敏試驗結(jié)果表

“S”為高敏；“I”為中度敏感；“R”為耐藥

2.4 16S rRNA基因序列分析結(jié)果 以S-1分離株純培養(yǎng)物DNA為模板，以細菌16S rRNA通用引物進行PCR擴增，瓊脂糖電泳檢測到16S rRNA的擴增片段約為1700 bp，與預期目的片段大小一致(圖2)。

圖2 S-1株分離菌16S rRNA PCR擴增結(jié)果(M：marker 2000；1：空白對照；2：分離株S-1)

將16S rRNA基因測序結(jié)果與GenBank中序列進行BLAST分析比對，分離菌與舒氏氣單胞菌的同源性最高，達99%以上(GenBank 序列號GQ844302.1)，由此確定該分離菌為舒氏氣單胞菌。

2.5 動物回歸試驗結(jié)果 試驗魚攻毒24 h后，2個攻毒劑量均開始出現(xiàn)死亡，死亡癥狀表現(xiàn)為：鰓蓋四周出血，內(nèi)臟各臟器黑色，腸道透明出血。各劑量組試驗魚死亡情況見表3。試驗魚觀察至第14天，實驗組僅存的1尾魚進行解剖，可見臟器散在小白點，這與最初分離的癥狀相符，對病魚進行病原菌進行分離純化，革蘭氏染色及16S rRNA鑒定，結(jié)果均與分離株S-1相同。

表3 分離株S-1攻毒試驗結(jié)果表

3 討論與小結(jié)

烏鱧常見主要細菌性疫病主要有由殺鮭氣單胞菌(AeromonasSalmonicida)[4]；嗜水氣單胞菌(Aeromouashydrophila)；維氏氣單胞菌(Aeromouasverouii)；河弧菌(Vibriofluvialis)等引起的出血病、由嗜水氣單胞菌(Aeromouashydrophila)引起的腐皮病、由費氏枸櫞酸桿菌(Citrobacterfreuudii)等引起的腹水病[5]、鰤諾卡菌(Nocardiaseriolea)引起的結(jié)節(jié)病[6]等。雖然烏鱧魚的抗病能力較強，但由于養(yǎng)殖密度和集約化程度提高，水環(huán)境差等多種原因，烏鱧各種細菌性病害頻繁發(fā)生，影響了烏鱧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本試驗從皮表潰爛，肝、腎和脾臟有不同程度白色病灶的瀕死烏鱧肝臟和腎臟中分離得到S-1株菌，經(jīng)形態(tài)特性、培養(yǎng)特性、生化特性、分子生物學鑒定試驗、綜合人工本動物回歸試驗確定為確定為舒氏氣單胞菌。舒氏氣單胞菌是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的氣單胞菌新種[7]，是人-畜-魚共患病原菌[8-10]。對于舒氏氣單胞菌在水生動物的相關(guān)報道和深入研究不多，J Y Liu[11]、Y F Chen[12]、羅霞[13]也證實了舒氏氣單胞菌是對烏鱧危害嚴重的致病菌。余華等[14]在溫泉魚體內(nèi)分離到致病的舒氏氣單胞菌。

從藥敏試驗結(jié)果來看，該分離株對大多數(shù)的抗菌藥和殺菌藥物都敏感，余華[14]報道分離的舒氏氣單胞菌對頭孢類抗生素(頭孢曲松、頭孢氨噻虧)和壯觀霉素等敏感。J Y Liu[11]報道分離的舒氏氣單胞菌對頭孢菌素V，氯霉素，環(huán)丙沙星，氟苯尼考等敏感。Y F Chen[12]頭孢哌酮和頭孢西丁、氯霉素，但耐氨卞青霉素，青霉素，克林霉素，苯唑西林等。在日常防治由該菌引起的魚體發(fā)病時，除加強日常飼養(yǎng)管理外，可選用該菌的敏感藥物進行這類疾病的防治。但防控該病時應該嚴格遵循國家制定的相關(guān)漁藥使用法規(guī)，不使用氯霉素等禁藥，正確合理使用藥物，保障該產(chǎn)業(yè)的綠色健康發(fā)展，確保人類的食品安全。

本研究中主要對發(fā)病烏鱧進行病原菌分離鑒定和藥物敏感性試驗，分離菌的藥物敏感性試驗結(jié)果可為有效藥物的選擇提供參考。本試驗的結(jié)果為疫苗的開發(fā)應用及本病的防治提供了理論基礎(chǔ)。

[1] 房海，陳翠珍，張曉君.水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原細菌學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

[2] R.E.Buchanan，N.E.Gibbons.《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》[M]. 第8版，北京：科學出版社，1984.

[3] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twentieth informational supplement [S].

[4] 周冬仁，羅毅志，杭小英，等.1株烏鱧源殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種的分離與鑒定[J].海洋湖沼通報，2015,38(3): 64-70.

[5] 吳同壘，單曉楓，王桂芹，等. 烏鱧主要病害的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，9(上):29-31.

[6] 王國良，徐益軍，金珊，等.養(yǎng)殖烏鱧諾卡菌病及其病原研究[J].水生生物學報，2009，33 (2) :277-283.

[7] 陸承平.獸醫(yī)微生物學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2007:127-130.

[8] Kannan S, Chattopadhyay U K, Pal D,etal.Isolation and identification of aeromonas from patients with acute diarrhoea in Kolkata, India[J].Indian J Med Microbiol，2001，19:190-192.

[9] 高海英，潘慧英，王芳.江陰市首次從食品中檢出舒伯特氣單胞菌[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2002，12 (3):329.

[10]劉向前，申作江，陳建文，等.一起由舒伯特氣單胞菌引起的食物中毒調(diào)查報告[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，1999，26 ( 4 ) : 536 -537.

[11]J Y Liu，A H Li. First case of Aeromonas schubertii infection in the freshwater cultured snakehead fish, Ophiocephalus argus (Cantor), in China [J]. Journal of Fish Diseases, 2012, 35(5):335-342.

[12]Y F Chen, R S Liang, X L Zhuo,etal.Isolation and characterization of Aeromonas schubertii from diseased snakehead, Channa maculata (Lacepe`de) [J]. Journal of Fish Diseases, 2012, 35(6):421-430.

[13]羅霞，鄧國成，廖國禮，等. 斑鱧內(nèi)臟白點病病原的分離鑒定[J].大連海洋大學學報，2012，27(4)：95-100.

[14]余華，何智，嚴玉寶，等.溫泉魚致病性類志賀鄰單胞菌和舒氏氣單胞菌的分離鑒定和藥敏試驗[J].中國動物檢疫，2009, 26(7):37-39.

(編輯：侯向輝)

Isolation, Identification and Drug Susceptibility of Aeromonas schubertii in Snakeheaded Fish

QI Dong-mei1, XU Hui1，YI Ting2, WANG Han-qing1, HU Wen-jun1, ZHANG Zhen1, LIN Xu-ye1*

(1.GuangdongWinsunBio-pharmaceuticalco.,ltd，Guangzhou511356，China；2.GuangzhouWhampoaMilitaryAcademyMemorialMiddleSchool，Guangzhou510770，China)

Bacterial pathogen was isolated in a snakeheaded fish farm in Foshan, Guangdong province. S-1 strain pathogenic bacterium was isolated from sick snakeheaded fish; the isolated bacterium was identified by morphological characteristics, biochemical characteristics researches, amplification of 16S rRNA by PCR and drug susceptibility test, experimental infection test. The isolated bacterium was confirmed asAeromonasschubertii. Drug susceptibility test results showed that the isolated bacterium were sensitive to spectinomycin, minocycline, gentamycin, ofloxacin, norfloxacin and cephalosporin etc. The results provided scientific bases for detection and treatment ofAeromonasschubertii.

snakehead fish；Aeromonasschubertii；isolation and identification；drug susceptibility

齊冬梅，博士，從事微生物學與免疫學研究。

林旭埜。E-mail: lxy68@21cn.com

2015-10-16

A

1002-1280 (2016) 02-0011-04

S852.61