唐波，張道華，唐應(yīng)華，常晨，劉國陽，華濤，張雪花，侯繼波

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014)

免疫增強(qiáng)劑提升豬用滅活疫苗免疫效力的研究

唐波，張道華*，唐應(yīng)華，常晨，劉國陽，華濤，張雪花，侯繼波

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014)

為評價免疫增強(qiáng)劑對豬細(xì)小-乙腦二聯(lián)滅活疫苗的免疫效力提升作用，將免疫增強(qiáng)劑以伴侶形式與疫苗共同混合免疫5～6月齡陰性后備母豬和種公豬，檢測其抗體水平。結(jié)果顯示，免疫增強(qiáng)劑與疫苗混合免疫后1周抗體全部轉(zhuǎn)陽，免疫后1～6月平均抗體效價均顯著高于不含免疫增強(qiáng)劑的常規(guī)疫苗組，表明該免疫增強(qiáng)劑能夠顯著提升豬細(xì)小-乙腦二聯(lián)滅活疫苗對后備母豬和種公豬的免疫效力。

免疫增強(qiáng)劑；豬細(xì)小病毒；豬乙腦病毒；滅活疫苗；免疫效果

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV) 與乙腦病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是引起豬繁殖障礙病的重要病原[1-2]。目前國內(nèi)細(xì)小病毒陽性感染率超90%，受感染公豬可通過精液長時間排毒[3]。滅活疫苗仍是目前預(yù)防細(xì)小感染最有效方法[4-5]。我國預(yù)防豬乙腦的疫苗為SA14-14-2弱毒活疫苗，然而在豬群中廣泛接種減毒活疫苗存在著一定風(fēng)險，而滅活疫苗對解決活疫苗潛在危險具有重要意義[6]。但是滅活疫苗免疫后仍存在抗體水平低和免疫保護(hù)期短等問題，如何提升現(xiàn)有滅活疫苗免疫效力成為臨床上急需解決的難題。使用一種既可以增強(qiáng)疫苗免疫效力又可以大大減少抗原含量降低生產(chǎn)成本的免疫增強(qiáng)劑顯的尤為重要。隨著規(guī)模化養(yǎng)豬發(fā)展，迫切需要能一針多防且免疫效果好的聯(lián)苗。研制聯(lián)苗不但可以簡化免疫程序，還可以顯著降低接種應(yīng)激反應(yīng)從而提高疫苗整體免疫效果。

機(jī)體免疫系統(tǒng)均存在模式識別受體[7]，這些受體能對外來病原的特定小分子物進(jìn)行識別，繼而激發(fā)機(jī)體免疫功能[8]。目前應(yīng)用比較廣泛的一些天然免疫受體及其激動劑類小分子類物質(zhì)就是機(jī)體免疫系統(tǒng)的高效刺激分子，在機(jī)體疫應(yīng)答過程中發(fā)揮十分重要的作用[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，含天然受體激動劑的復(fù)方免疫增強(qiáng)劑能夠有效提升滅活疫苗對雞的免疫效力[11]。本研究對有效提升禽用滅活疫苗免疫效力的VA5復(fù)方免疫增強(qiáng)劑進(jìn)行了研究，以評價其對豬用滅活聯(lián)苗的免疫增強(qiáng)效果。

1 材料和方法

1.1 疫苗和檢測試劑 豬細(xì)小、乙腦二聯(lián)滅活疫苗為本室制備，細(xì)小病毒含量為每1 mL 107.4TCID50，乙腦病毒含量為每1 mL 107.5TCID50；細(xì)小疫苗毒株及HI檢測用抗原為PPV-NJ株，乙腦疫苗毒株為JEV-JS株。豬細(xì)小病毒ELISA抗體檢測試劑盒，購自深圳綠詩源生物技術(shù)有限公司；豬乙腦病毒ELISA抗體檢測試劑盒，購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司。

1.2 試驗動物 5～6月齡陰性后備母豬和公豬(豬細(xì)小病毒HI抗體陰性)，購自江蘇明天農(nóng)牧科技公司。

1.3 疫苗的制備 含VA5 免疫增強(qiáng)劑疫苗的配制詳見專利( 申請?zhí)?01210235427.0)。按要求將免疫增強(qiáng)劑配成油乳劑疫苗伴侶，將疫苗伴侶與常規(guī)豬細(xì)小、乙腦二聯(lián)滅活疫苗按體積比1︰9混合，該混合液即為含免疫增強(qiáng)劑的豬細(xì)小、乙腦二聯(lián)滅活疫苗滅活疫苗。

1.4 抗體水平檢測

1.4.1 豬細(xì)小病毒血凝抑制抗體(HI)的檢測 將分離的100 uL血清56 ℃水浴滅活30 min后，加入300 uL 25%白陶土懸液，混勻，置室溫下作用30 min；以10000 r/min離心10 min，吸取上清，加入100 uL 20%的豚鼠紅細(xì)胞泥，振蕩混勻后37 ℃作用1 h以4000 r/min離心10 min，收集上清即為待檢血清樣品。參照文獻(xiàn)中[12]HI檢測方法來評價免疫后抗體消長規(guī)律。1.4.2 間接ELISA抗體檢測 將分離待檢血清按照ELISA檢測試劑盒使用說明書的方法進(jìn)行PPV、JEV ELISA抗體。通過酶標(biāo)儀讀取OD630值，測定血清樣品ELISA抗體效價，OD630﹥0.32判為陽性。

1.5 疫苗免疫試驗 選健康后備母豬和種公豬各15頭，分別設(shè)常規(guī)疫苗免疫組、伴侶疫苗免疫組、空白對照組，每組5頭。免疫組分別每頭2.0 mL肌肉注射，于免疫后1周、2周、3周、4周、2月、3月、4月、5月、6月采血，分別用檢測血清中PPV、JEV抗體。

2 結(jié)果與分析

2.1 含免疫增強(qiáng)劑疫苗免疫后備母豬試驗結(jié)果

2.1.1 后備母豬PPV HI抗體檢測結(jié)果 常規(guī)疫苗免疫組1周后HI抗體部分轉(zhuǎn)陽(HI抗體不低于6)，2周后全部為陽性，1～3個月HI抗體處于較高水平，至免疫后4～6個月有所下降。含免疫增強(qiáng)劑疫苗免疫組1周后HI抗體全部轉(zhuǎn)陽，免疫后1～6個月抗體水平均維持在較高水平且明顯高于常規(guī)疫苗免疫組(圖1)。

2.1.2 后備母豬PPV ELISA抗體檢測結(jié)果 PPV滅活疫苗免疫后備母豬后的ELISA抗體檢測結(jié)果表明，各免疫組免疫后1周ELISA抗體全部轉(zhuǎn)陽(OD630≥0.32)，第2周后抗體水平均有大幅度的提升。常規(guī)疫苗組免疫后第4個月開始下降，含免疫增強(qiáng)劑疫苗組免疫后1～6個月抗體水平均維持在較高水平。含免疫增強(qiáng)劑組在各個時間段的抗體水平均明顯高于常規(guī)疫苗免疫組(圖2)。

圖1 后備母豬免疫后PPV HI抗體檢測結(jié)果

圖2 后備母豬免疫后PPV ELISA抗體檢測結(jié)果

2.1.3 后備母豬JEV ELISA抗體檢測結(jié)果 免疫后不同時間點分別采集血液分離血清，測定JEV ELISA抗體。結(jié)果見圖3，常規(guī)疫苗免疫組免疫后1周ELISA抗體全部轉(zhuǎn)陽(OD630≥0.32)，3～9周抗體水平維持教高水平，免疫后第3個月開始逐漸下降。而含免疫增強(qiáng)劑疫苗組3周到6個月均能維持在較高水平且在各個時間段的抗體水平均明顯高于常規(guī)疫苗免疫組。

2.2 含免疫增強(qiáng)劑疫苗免疫種公豬試驗結(jié)果

2.2.1 種公豬PPV HI抗體檢測結(jié)果 公豬在免疫后各個時間段采集的血清進(jìn)行HA檢測，得到HI抗體水平消長曲線。由圖4可知，常規(guī)疫苗免疫組1周后HI抗體部分轉(zhuǎn)陽(HI抗體不低于1︰6)，2周后全部為陽性，免疫后4周HI抗體達(dá)到峰值，3～6個月有所下降。含免疫增強(qiáng)劑疫苗免疫組1周后HI抗體全部轉(zhuǎn)陽，免疫后1～6個月抗體水平均維持在較高水平。

圖3 后備母豬免疫后JEV ELISA抗體檢測結(jié)果

圖4 公豬免疫后PPV HI抗體檢測結(jié)果

2.2.2 種公豬PPV ELISA抗體檢測結(jié)果 ELISA檢測PPV滅活疫苗免疫種公豬后各個時間點血清抗體水平。由圖5可知含免疫增強(qiáng)劑疫苗免疫組免疫后1周后很快產(chǎn)生ELISA抗體，免疫后4周HI抗體達(dá)到峰值，1～6個月均維持在較高水平。常規(guī)疫苗組各個時間點血清抗體水平則明顯低于含免疫增強(qiáng)劑組。

圖5 公豬免疫后PPV ELISA抗體檢測結(jié)果

2.2.3 種公豬JEV ELISA抗體檢測結(jié)果 疫苗免疫種公豬后JEV ELISA抗體檢測結(jié)果表明，所有免疫組種公豬免疫后免疫1周抗體全部轉(zhuǎn)陽隨后抗體效價逐步增高。常規(guī)疫苗免疫后第3個月開始逐漸下降。而含免疫增強(qiáng)劑疫苗組免疫后3周至6個月均能維持在較高的水平，抗體水平在各個時間點均顯著高于常規(guī)疫苗免疫組(圖6)。

圖6 公豬免疫后JEV ELISA抗體檢測結(jié)果

3 討論與小結(jié)

豬細(xì)小和乙腦疫苗主要是應(yīng)用于母豬和種公豬，本試驗將VA5復(fù)方免疫增強(qiáng)劑以伴侶形式與疫苗混合分別免疫5～6月齡陰性后備母豬和種公豬。免疫后1周抗體很快全部轉(zhuǎn)陽，常規(guī)疫苗免疫后第3個月開始逐漸下降，而含增強(qiáng)劑疫苗組免疫后1～6個月抗體水平全部維持在較高水平且顯著高于常規(guī)滅活疫苗。試驗表明該免疫增強(qiáng)劑在后備母豬和種公豬上使用均能很快提升疫苗的抗體效價并能有效延長抗體持續(xù)期。

有研究報道，CpG-ODN受體激動劑和poly(I:C)這類物質(zhì)能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，在機(jī)體的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用[13]。本研究使用的VA5復(fù)方免疫增強(qiáng)劑中含有這類天然免疫受體激動劑，其在禽流感、馬立克病等滅活疫苗的免疫效力提升上具有十分顯著的作用[14]。該增強(qiáng)劑不僅能夠提高禽流感單苗的免疫效力對禽用二聯(lián)疫苗也同樣具有免疫增強(qiáng)作用，使得機(jī)體免疫二聯(lián)苗后比常規(guī)二聯(lián)苗提前產(chǎn)生抗體且效價明顯提升[15]。使用免疫增強(qiáng)劑是目前提升滅活疫苗保護(hù)效力的有效途徑。該免疫增強(qiáng)劑對豬用滅活疫苗免疫效力影響以及免疫機(jī)理的研究報道尚少。

本試驗中含VA5復(fù)方免疫增強(qiáng)劑的豬用聯(lián)苗在免疫豬后不僅可以誘導(dǎo)高水平抗體產(chǎn)生，同時還減少了免疫次數(shù)以及對豬體的應(yīng)激反應(yīng)，大大提高生產(chǎn)效率具有良好的推廣應(yīng)用前景。這為我們進(jìn)一步開展豬細(xì)小-乙腦二聯(lián)滅活疫苗后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

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(編輯：李文平)

Evaluation of Immunopotentiators for Improving the Efficacy of Porcine Inactived Vaccine

TANG Bo，ZHANG Dao-hua*，TANG Ying-hua，CHANG Chen，LIU Guo-yang，HUA Tao, ZHANG Xue-hua, HOU Ji-bo

(NationalResearchCenterofEngineeringandTechnologyforVeterinaryBiologicals,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014，China)

To evaluate the immunopotentiator for improving the efficacy of inactived porcine parvovirus and Japanese encephalitis vaccines, the immunopotentiator was mixed with chaperon form of vaccine. Replacement gilts and boars were inoculated with the vaccine for immunization, and the hemagglutinin inhibition (HI) titer and ELISA of sera were measured. The results showed a high antibody titer of immunopotentiators group were elevated significantly after vaccinated. The immunopotentiator is effective in prolonging the antibody persistence period. The antibody is all positive for one week later, and antibody level were significantly higher than conventional group during six months. In sum, the immunopotentiator can improve the efficacy on porcine inactivated vaccine in replacement gilt and boar.

immunopotentiators；porcine parvovirus；Japanese encephalitis virus； inactivated vaccine；immune effect

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目[CX(11)2047]；農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201303046)

唐波，碩士，從事動物分子病原學(xué)及免疫學(xué)研究。

張道華。E-mail: 2005107058@163.com

2016-03-17

A

1002-1280 (2016) 06-0005-05

S858.28