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摘要：以干燥的驢皮張樣品為試驗(yàn)材料，將SDS-蛋白酶K法與Chelex-100法相結(jié)合，創(chuàng)新性地引入玻璃奶DNA純化技術(shù)，提取全基因組DNA，并將此方法與前人發(fā)表的陳舊皮張DNA提取方法和試劑盒提取方法進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，本研究發(fā)明方法提取的基因組DNA純度較高，雜質(zhì)較少，且操作簡(jiǎn)單，所用試劑、儀器費(fèi)用較低，能更好地應(yīng)用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：動(dòng)物皮張；DNA提取；玻璃奶

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）12-0006-04

DNA為分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，隨著生物領(lǐng)域尤其是遺傳學(xué)方面研究的日漸深入，從分子水平上對(duì)動(dòng)物進(jìn)行物種鑒定、物種起源和多樣性評(píng)估及其親緣關(guān)系研究已獲得廣泛應(yīng)用。20世紀(jì)80年代就已開始動(dòng)物皮張標(biāo)本DNA提取的研究，盡管提取成功的報(bào)道很多，但提取的基因組DNA含量較低，片段較短，且難以進(jìn)行PCR擴(kuò)增；提取方法雖然不斷改善，但得到的DNA質(zhì)量仍舊不是很高。

當(dāng)前皮張?jiān)葱澡b定方法滯后，國(guó)內(nèi)外仍然沒有統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和較成熟的鑒別方法，傳統(tǒng)的宏觀觀察法、顯微鏡觀察法具有一定的主觀性，無法準(zhǔn)確和快速地區(qū)分皮張?jiān)葱?。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于DNA的生物學(xué)鑒定手段逐漸豐富起來。DNA分子鑒定法主要是利用顯示生物特征的各生物物種所具有的不同DNA序列信息進(jìn)行源性鑒別，它可以突破依據(jù)動(dòng)物纖維結(jié)構(gòu)形態(tài)進(jìn)行鑒定的局限性，與傳統(tǒng)分析方法相比，更加客觀和準(zhǔn)確。因此，獲得高質(zhì)量的動(dòng)物皮張基因組DNA已成為進(jìn)行皮張?jiān)葱澡b定研究的迫切要求。

本試驗(yàn)以SDS法為基礎(chǔ)，將蛋白酶K、Chelex -100與Glass Milk DNA提取技術(shù)相結(jié)合，并將此方法與前人發(fā)表的陳舊皮張DNA提取新方法和DNA提取試劑盒法進(jìn)行比較分析，旨在研建一種操作簡(jiǎn)便、DNA提取效率高、花費(fèi)較為低廉的優(yōu)化方法，為后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供必要條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

9份干燥的驢皮樣品，分別編號(hào)為1～9。每份樣品平均分為三份，分別用于A、B、C三種方法。材料由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心測(cè)序中心提供。

1.2 試驗(yàn)試劑

（1）消化緩沖液A（10mmol/L Tris-HCl，25mmol/L EDTA， 100mmol/L NaCl，0.5%SDS， pH8.0）、Chelex-100、20mg/mL蛋白酶K、氯仿、Glass Milk、DNA Binding Buffer、70%酒精、無水乙醇、TE緩沖液、超純水。

（2）消化緩沖液B（10mmol/L Tris-HCl，0.5% SDS，1mmol/L CaCl₂，0.2mg/mL蛋白酶K， pH 8.0）、1μmol/L EDTA、10% Chelex溶液、酚、氯仿、異戊醇、3mol/L NaAc、無水乙醇、75%酒精、TE緩沖液、超純水。

（3） DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.TissueDNA Kit）。

（4） HiFi Buffer： TransTaq DNA PolymoraseHigh Fidelity購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取 方法A：取約30mg驢皮樣品研磨至微粒，分別裝到編號(hào)為A1～A9的2mL EP管中，加1mL去離子水洗滌2次；加入400μL消化緩沖液A以及380μL5%的Chel-ex-100和20μL 20mg/mL的蛋白酶K，50～600C水浴保溫，期間攪拌混勻，至全部溶解；取出冷卻至室溫，振蕩5～10s，100℃沸水浴8min；結(jié)束后取出樣品，10000r/min離心1min，取上清轉(zhuǎn)至新的EP管（記錄上清體積），加等體積氯仿，充分混勻，12000r/min離心5min，重復(fù)此步驟兩次；向收集液中加入5μL Glass Milk，并加600μL DNA Binding Buffer.充分混勻，65℃水浴15min；后室溫放置5min，8000r/min離心1min，棄上清；加入70%酒精500μL進(jìn)行洗滌，8000r/min離心1min，重復(fù)此步驟兩次；加入500μL無水乙醇，吹打懸浮，8000r/min離心1min，棄上清；8000r/min離心30s，用10μL槍頭吸走殘余液體，室溫干燥10min；加入50μL TE緩沖液（pH 7.0），70℃水浴5min，快速離心，移至新離心管，- 200C保存。

方法B參考陳舊皮張DNA提取新方法[12]。

方法C參考DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Tissue DNA Kit）。

1.3.2 基因組DNA檢測(cè) （1）紫外分光光度計(jì)檢測(cè)：每份DNA樣品分別取2μL測(cè)定其濃度及A₂₆₀和A₂₈₀。每個(gè)樣品做三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取均值。

（2）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：配置2.0%的瓊脂糖凝膠，取1×Loading Buffer 10μL，加入2μL基因組DNA樣品，混合均勻后加入點(diǎn)樣孔中，同時(shí)加入DNA Marker，180V電泳10min。電泳結(jié)束后，利用凝膠成像儀進(jìn)行拍攝，保存圖像，根據(jù)樣品的條帶亮度、整齊度及位置，粗略估計(jì)其純度及片段大小。

（3） PCR擴(kuò)增檢測(cè)：根據(jù)驢線粒體基因組（16S rRNA）細(xì)胞色素b特異序列，利用PrimerPremier 5.0設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物MtUF：5' -ATAAGACGAGAAGACCCTATCCAGC -3'，下游引物MtUR：5-ACCAITITCTGITCTCCGAGGTCAC -3'，擴(kuò)增目的片段250 bp。在擴(kuò)增之前分別將三種方法提取的共27份基因組DNA稀釋到100 ng/yL待用。PCR反應(yīng)總體積為25μL，其中ExTaq聚合酶0.2μL，HiFi Buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，模板2.0μL，ddH₂0 16.3μL。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 三種方法提取的基因組DNA紫外分光光度計(jì)檢測(cè)

由表1可知，A、B、C三種方法獲得的DNA質(zhì)量在A₂₆₀和A₂₈₀值上有明顯區(qū)別，B方法的A₂₆₀值最高達(dá)100以上，A₂₈₀值最高也達(dá)到50以上；C方法雖然A₂₆₀和A₂₈₀值比B方法稍低，但總體上數(shù)值仍然偏高。原因可能是B和C兩方法提取的DNA純度不高，含有較多苯酚、鹽酸胍、聚乙二醇等雜質(zhì)。過多的雜質(zhì)污染進(jìn)而導(dǎo)致樣品濃度過高，兩方法獲得DNA濃度均大于500ng/μL，遠(yuǎn)高于方法A的DNA濃度。利用方法A提取的DNA濃度范圍為74.8～177.5ng/μL，A₂₆₀/A₂₈₀在2.0左右，雖仍有部分RNA污染，但DNA純度相對(duì)B、C兩方法要好。

2.2 三種方法提取的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳分析

從瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出，三種方法均可從驢皮張中提取出基因組DNA，但獲得的DNA量有顯著差別。其中A方法的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖條帶最弱，出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，提取量最少（圖1）；B方法的基因組DNA提取量相對(duì)A方法稍多，但DNA降解較為嚴(yán)重，且雜質(zhì)較多，不夠純凈（圖2）；C方法的基因組DNA提取量相對(duì)于A、B兩方法最多，條帶最為明亮，提取效果最好，但存在降解現(xiàn)象及RNA等雜質(zhì)污染（圖3）。

2.3 三種方法提取的基因組DNA的PCR擴(kuò)增檢測(cè)

以三種方法提取的基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)合成的引物擴(kuò)增目的片段。由圖4～6可知，三種方法均能很好地進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，且條帶清晰，帶型整齊，說明三種方法均能從干燥的驢皮張中提取較好質(zhì)量的基因組DNA，且都能夠應(yīng)用于后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)論與討論

玻璃奶是一種特殊制備的以二氧化硅作為懸浮物的水溶液，具備快速、定量、特異性結(jié)合DNA的能力，可以取代有毒的有機(jī)物苯酚、氯仿等用于分離和純化DNA。在高鹽溶液中，核酸是不溶的，可被吸附至玻璃基質(zhì)上，而蛋白質(zhì)在高鹽溶液中是高度溶解的，脂類物質(zhì)懸浮于溶液表面，從而起到純化分離DNA的作用。將二氧化硅用于DNA的純化最早見于Engelstein等的報(bào)道，他們采用此法純化出了測(cè)序級(jí)的模板DNA。該法不僅杜絕了如酚、氯仿等對(duì)身體有毒害藥品的使用，而且可達(dá)到高效、快速、批量提取DNA的目的，具有經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、高效、無毒的特點(diǎn)。本研究利用SDS-蛋白酶K結(jié)合Chelex-100法提取動(dòng)物皮張中的微量DNA，能獲取較高濃度的DNA，進(jìn)一步利用玻璃奶DNA純化技術(shù)能顯著去除殘留的蛋白和金屬離子等污染，顯著提高了DNA純度。

將本研究使用Chelex-100結(jié)合玻璃奶提取驢皮張全基因組DNA的方法與前人報(bào)道方法和試劑盒法提取所得基因組DNA分別利用紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳以及PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行評(píng)估，綜合分析可知，A方法所提基因組DNA雖然量較少但純度較高，電泳均能顯示出條帶，并且能夠很好地?cái)U(kuò)增目的片段，滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求，此外，所用試劑、儀器費(fèi)用較低且操作較為簡(jiǎn)單，耗時(shí)14小時(shí)，相對(duì)B方法時(shí)間較短。B方法獲取的基因組DNA濃度較高，也能用于PCR擴(kuò)增目的條帶，雖然操作以及儀器試劑和A方法相似，但基因組DNA電泳條帶及吸光值顯示其存在蛋白質(zhì)、RNA以及其他雜質(zhì)污染，且電泳條帶也不是很整齊，耗時(shí)20小時(shí)，時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。C方法所提基因組DNA濃度居中，條帶清晰整齊，能很好地進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增，但從其吸光值來看，可能存在較多的酚、聚乙二醇、鹽酸胍等雜質(zhì)污染，且試劑盒價(jià)格相對(duì)較為昂貴。

綜上所述，本研究三種方法均可用于干燥動(dòng)物皮張基因組DNA的提取，通過對(duì)比分析，方法A即本研究發(fā)明的SDS -蛋白酶K結(jié)合Chelex-100法和玻璃奶純化技術(shù)提取獲得的基因組DNA純度較高，雜質(zhì)較少，且操作簡(jiǎn)單，所用儀器、試劑均價(jià)格低廉，相對(duì)于方法B和C能更好地應(yīng)用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。endprint