李蕓蕓

英國(guó)倫敦大奧德蒙街醫(yī)院和倫敦大學(xué)學(xué)院兒童健康研究所的研究人員最近采用一種新的基因療法——分子剪刀（基因剪刀）來(lái)編輯基因，產(chǎn)生設(shè)計(jì)的免疫細(xì)胞，用來(lái)治療耐藥性的白血?。ㄑ?，成功治愈了一名一歲大的白血病患兒。利用基因剪刀來(lái)治療罕見(jiàn)病、難治病，尤其是遺傳性疾病，是當(dāng)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個(gè)方向。不過(guò)，基因療法有多種，僅僅是利用基因剪刀的方式就有多種。

基因剪刀修飾細(xì)胞

一歲的蕾拉·理查茲患有復(fù)發(fā)性急性淋巴細(xì)胞白血病，是一種難以治愈的白血病。盡管藥物化療能治愈一些白血病，但化療對(duì)于復(fù)發(fā)性急性淋巴細(xì)胞白血病還是束手無(wú)策。此前，蕾拉已經(jīng)接受過(guò)化療，但效果不佳，只能用姑息療法維持生命。在走投無(wú)路之時(shí)，大奧德蒙街醫(yī)院向蕾拉的父母提議可以試用新的基因療法，而且，這種療法已經(jīng)在小鼠身上進(jìn)行過(guò)試驗(yàn)，效果較好。

為了挽救女兒的生命，蕾拉的父母同意了。蕾拉的父母熱衷于嘗試新療法，蕾拉的媽媽莉莎說(shuō)：“我們不想接受姑息治療，所以我們要求醫(yī)生為我們的女兒嘗試任何治療，哪怕是以前沒(méi)有嘗試過(guò)的。”而且，治療方案也經(jīng)過(guò)了醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且由掌握這一特定基因修飾方式的法國(guó)Cellectis生物科技公司提供經(jīng)過(guò)基因修飾的T細(xì)胞。

由于蕾拉患復(fù)發(fā)性急性淋巴細(xì)胞白血病，體內(nèi)正常的免疫T細(xì)胞已經(jīng)很少，因此需要利用他人（供體）捐贈(zèng)的健康T細(xì)胞。在利用之前，要對(duì)供體T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，即用一種基因剪刀——轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）向健康的供體T細(xì)胞添加新的基因，將它們武裝起來(lái)對(duì)抗白血病。

TALEN是一種可靶向修飾特異基因序列的酶，它借助于TAL效應(yīng)子（一種由植物細(xì)菌分泌的天然蛋白）來(lái)識(shí)別特異性DNA堿基對(duì)。TAL效應(yīng)子可被設(shè)計(jì)來(lái)識(shí)別和結(jié)合所有的目的DNA序列。對(duì)TAL效應(yīng)子附加一個(gè)核酸酶就生成了TALEN。TAL效應(yīng)核酸酶可與DNA結(jié)合并在特異位點(diǎn)對(duì)DNA鏈進(jìn)行切割，從而導(dǎo)入新的遺傳物質(zhì)（基因）。此前，TALEN的特異性切割活性在酵母、擬南芥、水稻、果蠅及斑馬魚(yú)等多個(gè)動(dòng)植物體系和體外培養(yǎng)細(xì)胞中得到驗(yàn)證。

利用TALEN對(duì)供體T細(xì)胞中的特定基因進(jìn)行切割后會(huì)呈現(xiàn)兩種效應(yīng)。一是治療白血病的藥物不能損傷和殺滅基因修飾的T細(xì)胞，二是這種被修飾的T細(xì)胞被重新編程，因此，輸入蕾拉的體內(nèi)只是去殺滅其體內(nèi)病變的白細(xì)胞。這種被修飾的T細(xì)胞稱為UCART19細(xì)胞。

UCART19細(xì)胞由Cellectis公司研發(fā)，大奧德蒙街醫(yī)院的研究人員通過(guò)靜脈注射，用10分鐘的時(shí)間把1毫升的UCART19細(xì)胞注入了蕾拉的血流中。然后對(duì)蕾拉進(jìn)行隔離，讓她不受感染，因?yàn)槔倮拿庖呦到y(tǒng)非常虛弱。幾周后，蕾拉體內(nèi)的白血病細(xì)胞就明顯消失。

然而，這并非是治療的結(jié)束。輸入的UCART19細(xì)胞只是殺滅了蕾拉體內(nèi)的白血病細(xì)胞，下一步還需要接受骨髓移植來(lái)重建蕾拉被治療摧毀的整個(gè)造血和免疫系統(tǒng)。不過(guò)，經(jīng)檢查，蕾拉的骨髓細(xì)胞是健康的，血細(xì)胞計(jì)數(shù)也在恢復(fù)正常。未來(lái)就是要找到一位配型相同的供者，由其提供健康的骨髓，移植到蕾拉體內(nèi)以重建蕾拉的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。所以，僅從蕾拉是白血病基因療法世界第一例看，也不過(guò)是基因剪刀治療白血病的第一步成功，或成功了一半，即把患者體內(nèi)的白血病細(xì)胞清除掉。

多種基因剪刀治療多種疾病

在利用UCART19細(xì)胞治療白血病之前，采用另一種基因剪刀——鋅指核酸酶（ZFN）治療艾滋病也獲得了初步成功。

ZFN又名鋅指蛋白核酸酶，并非自然存在，而是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，由一個(gè)DNA識(shí)別區(qū)域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成，其中DNA識(shí)別區(qū)域有特異性，在DNA特定位點(diǎn)結(jié)合，而非特異性核酸內(nèi)切酶有剪切功能，兩者結(jié)合可在DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)切割。

美國(guó)加利福尼亞州Sangamo生物科學(xué)公司用ZFN對(duì)供體T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，對(duì)T細(xì)胞上一個(gè)基因刪除和滅活，這個(gè)基因編碼的蛋白就是艾滋病病毒（HIV）進(jìn)入T細(xì)胞的結(jié)合靶分子，即T細(xì)胞受體CCR5δ32。ZFN修飾CCR5δ32基因可使其縮短，并導(dǎo)致其有名無(wú)實(shí)，HIV就難以識(shí)別這個(gè)T細(xì)胞的蛋白分子（大門(mén)），從而無(wú)法入侵T細(xì)胞，由此可以治療艾滋病。

2014年，Sangamo公司的費(fèi)奧多·烏爾諾夫研究小組對(duì)12名艾滋病患者試驗(yàn)，輸入經(jīng)過(guò)基因編輯的健康供者的T細(xì)胞，有效地抑制了HIV入侵T細(xì)胞，有6名患者停止服用抗HIV的藥物，說(shuō)明這種基因編輯療法初步體現(xiàn)了效果。由于有了初步結(jié)果，現(xiàn)在Sangamo公司正在擴(kuò)大試驗(yàn)，對(duì)70多名艾滋病患者試驗(yàn)這種基因編輯療法。

受到這種基因編輯療法治療結(jié)果的鼓舞，Sangamo公司還在擴(kuò)大基因療法的戰(zhàn)場(chǎng)。2015年10月，烏爾諾夫研究小組報(bào)告了他們用ZFN對(duì)猴子試驗(yàn)治療血友病的結(jié)果。研究人員對(duì)15只猴子注射攜帶編碼ZFN基因和凝血IX因子基因的病毒，以治療血友病。白蛋白是肝臟大量合成的血液蛋白，ZFN能切割基因組中編碼白蛋白的基因，并將一個(gè)健康的凝血IX因子基因?qū)牖蚪M中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，猴子肝臟開(kāi)始制造更多凝血IX因子，血液中凝血IX因子增加10%。

烏爾諾夫認(rèn)為，利用ZFN和TALEN基因剪刀可以治療多種疾病。例如，白蛋白基因類似人類基因組的一個(gè)USB接口，在這個(gè)位置也可利用ZFN或TALEN基因剪刀插入其他基因以治療疾病。

不過(guò)，Sangamo公司利用基因剪刀治療血友病還未取得美國(guó)食品與藥物管理局（FDA）的許可證。2015年9月美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）一個(gè)委員會(huì)同意開(kāi)展基因編輯治療的臨床研究，并可能對(duì)凝血IX因子基因治療開(kāi)綠燈?，F(xiàn)在Sangamo公司已經(jīng)向FDA提出申請(qǐng)，如果獲得FDA批準(zhǔn)，臨床試驗(yàn)可望在2016年展開(kāi)。

更直接的基因編輯治療疾病

無(wú)論是利用ZFN，還是TALEN基因剪刀治療疾病，目前還只是在對(duì)T細(xì)胞的某種基因進(jìn)行編輯、刪除以治療疾病，是一種間接的基因療法。更為直接的用基因剪刀切除致病基因的療法也在試驗(yàn)之中，這就是名為CRISPRCas的基因剪刀。

CRISPR的全稱是，成簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列，Cas則是指與CRISPR相關(guān)的基因。CRISPRCas技術(shù)是繼ZFN、胚胎干細(xì)胞（ES）打靶和TALEN等基因編輯技術(shù)后用于定點(diǎn)剪切、敲除特定基因的第四種方法，不僅可以用于治療疾病，還可能修改胚胎，創(chuàng)造新的物種，甚至創(chuàng)造“超人”。

現(xiàn)在，CRISPRCas治療疾病的一個(gè)試驗(yàn)是治療β地中海貧血。美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校的簡(jiǎn)悅威教授及其同事在2014年8月5日的《基因組研究》發(fā)表文章稱，他們嘗試用CRISPRCas治療β地中海貧血獲得初步成功。β地中海貧血是由HBB基因突變引起的，會(huì)造成嚴(yán)重的血紅蛋白缺乏。全球每10萬(wàn)人中有1人受到這種疾病的影響，目前還沒(méi)有能夠治愈β地中海貧血的辦法。

研究人員先將β地中海貧血患者的皮膚細(xì)胞（成纖維細(xì)胞）轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPSC），然后利用CRISPRCas編輯技術(shù)來(lái)糾正HBB特殊位點(diǎn)的DNA序列，即切割雙鏈DNA中HBB突變位點(diǎn)。然后，細(xì)胞自身會(huì)通過(guò)同源重組用正確的核苷酸序列修復(fù)DNA。經(jīng)過(guò)基因校正HBB突變之后的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞沒(méi)有檢測(cè)到脫靶效應(yīng)，細(xì)胞保持著完全的多能性，核型也很正常。

之后，研究人員把這些誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞分化為紅細(xì)胞，結(jié)果紅細(xì)胞的HBB表達(dá)恢復(fù)正常。不過(guò)，要將CRISPRCas編輯技術(shù)真正用于臨床治療β地中海貧血，還有較長(zhǎng)的路要走。

采用CRISPRCas編輯技術(shù)治療β地中海貧血的另一個(gè)思路和做法來(lái)自中國(guó)研究人員。中山大學(xué)的黃軍就等人，試圖用CRISPRCas9基因編輯技術(shù)對(duì)“不能存活”的胚胎（從當(dāng)?shù)厣吃\所獲得，無(wú)法生成活胎的胚胎）來(lái)改造β地中海貧血的基因HBB。研究小組將CRISPRCas9注入到86個(gè)胚胎中，結(jié)果顯示，有28個(gè)胚胎獲得了成功的拼接，替換了突變的HBB基因。

然而，這一研究引發(fā)了爭(zhēng)論。因?yàn)镃RISPRCas尚不能完全準(zhǔn)確剪切基因，所以有可能對(duì)胚胎造成傷害。因此，目前無(wú)論是利用CRISPRCas技術(shù)，還是ZFN、胚胎干細(xì)胞（ES）打靶，或是TALEN基因編輯技術(shù)，都局限在對(duì)細(xì)胞的基因編輯和敲除上，對(duì)于胚胎的基因敲除和剪切，風(fēng)險(xiǎn)很大。而且，這也涉及定制人和重造物種，倫理爭(zhēng)論很大，法律管理也遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后。

【責(zé)任編輯】張?zhí)锟?