杜翔宇,李溫明,胡振林,張?zhí)鹛?胡桂學(xué),董　浩

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春130118;2.鐵嶺出入境檢驗檢疫局,遼寧鐵嶺112616;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長春130118)

我國鵝細(xì)小病毒研究進展

杜翔宇1,李溫明2,胡振林1,張?zhí)鹛?,胡桂學(xué)3,董浩1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春130118;2.鐵嶺出入境檢驗檢疫局,遼寧鐵嶺112616;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長春130118)

1　小鵝瘟的流行病學(xué)

鵝細(xì)小病毒(GPV)屬于單股DNA病毒,在分類學(xué)上屬于細(xì)小病毒科,細(xì)小病毒亞科,細(xì)小病毒屬的成員.小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒引起的一種傳播快、死亡率高、高度接觸性急性或亞急性敗血性傳染病,大多發(fā)生在1個月齡以內(nèi)的雛鵝,2～3日齡的雛鵝即開始發(fā)病,7日齡以內(nèi)的雛鵝最易感染.該病具有較強的傳染性和較高的死亡率,隨著近年來對小鵝瘟病毒流行病學(xué)的研究發(fā)現(xiàn),小鵝瘟易感鵝群的發(fā)病日齡有逐漸增大的趨勢,而且呈現(xiàn)無規(guī)律散發(fā)性流行.黃宇翔等采用臨床調(diào)查、血清學(xué)和病原學(xué)檢測技術(shù)進行了鵝細(xì)小病毒病、鵝副黏病毒病流行病學(xué)調(diào)查,結(jié)果表明,鵝細(xì)小病毒流行季節(jié)為4～8月份,發(fā)病率為60%～70%;鵝副黏病毒病流行季節(jié)為5～7月份,發(fā)病率10%～20%.二者共同點是對雛鵝有高度的致病性,尤其10日齡以內(nèi)雛鵝感染后,發(fā)病率和死亡率在90%以上,甚至可達(dá)100%[1].

2　GPV的分子生物學(xué)特征

2.1GPV的基因組特征GPV為DNA病毒,分為正鏈DNA和負(fù)鏈DNA,基因組全長約為5.2 kb(分子質(zhì)量約為6X106Da).GPV基因組的一大特點是正鏈與負(fù)鏈DNA分子均含有回文結(jié)構(gòu)的序列,小鵝瘟病毒的兩種DNA鏈在核酸提取很容易出現(xiàn)退火現(xiàn)象,二者結(jié)合變成互補的雙鏈DNA.病毒的整個基因組分為編碼區(qū)和非編碼區(qū),非編碼區(qū)位于編碼區(qū)兩側(cè),形成回文序列;編碼區(qū)處于中間位置,包含兩個開放閱讀框,分別包括左側(cè)LORF和右側(cè)RORF,有一個長短為18個堿基的片段將兩者隔開,LORF編碼NS1、NS2非結(jié)構(gòu)蛋白,RORF編碼VP1、VP2、VP3結(jié)構(gòu)蛋白,VP2和VP3蛋白是小鵝瘟的主要保護性抗原,可以誘發(fā)機體產(chǎn)生抗體,發(fā)生免疫反應(yīng).所有的編碼基因彼此重疊,結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因都有獨立的啟動子區(qū)域,具有共同的羧基末端,形成套式的結(jié)構(gòu). VP基因是GPV的重要基因,關(guān)系到病毒毒粒的衣殼蛋白,同時也作為抗原能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體,同時VP蛋白也關(guān)系到病毒的毒力和致病性.

目前僅有7個GPV毒株已知全基因序列,更多GPV毒株的全基因序列測定將有助于理解GPV的遺傳、演化、病毒嗜性、宿主域和致病性等相關(guān)信息.王浩等應(yīng)用PCR方法獲得GPVY株和E株的全基因組核苷酸序列,通過分析VP區(qū)糖基化位點的差異發(fā)現(xiàn)Y株和E株均缺失703-705 NRT糖基化位點,推測結(jié)構(gòu)蛋白糖基化位點的改變有可能影響病毒的毒力,甚至使病毒形成免疫逃逸[2].張云等采用PCR技術(shù)擴增了鵝和番鴨全長細(xì)小病毒基因,序列分析表明,鵝和番鴨細(xì)小病毒NS之間的核苷酸和氨基酸同源性分別為80.9%～82.9%和89.5%～91.2%,鵝和番鴨細(xì)小病毒VP1之間的同源性分別為79.7%～88.7%和85.5%～93.3%[3].王志強等對鵝細(xì)小病毒VP1-VP3非重疊區(qū)基因的克隆與序列分析,強毒株基因核苷酸序列變化低于弱毒株,這說明目前流行GPV強毒株的基因序列保守性高于弱毒株[4].

2.2結(jié)構(gòu)蛋白GPV能夠編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白,分別為VP1、VP2蛋白和VP3蛋白.小鵝瘟病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP的主要功能是刺激機體產(chǎn)生抗體,同時該結(jié)構(gòu)也與病毒的毒力和致病性有密切關(guān)系.馬波對鵝細(xì)小病毒VP1基因的原核表達(dá)及抗原性分析,結(jié)果表明,純化的融合蛋白可與GPV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),具有良好的抗原性[5].胡曉靜等對2株鵝細(xì)小病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因的克隆和序列分析,VP2的核苷酸序列全長分別為2 044 bp和2 050 bp,與番鴨細(xì)小病毒的同源性為76.8%～80.0%,為細(xì)小病毒載體的構(gòu)建和基因工程疫苗的設(shè)計奠定基礎(chǔ)[6].

VP3蛋白在3種核衣殼蛋白中是含量最多,且在GPV或MDPV感染的水禽體內(nèi)能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生,VP3是檢測GPV或MDPV抗體最合適的候選蛋白.李永峰建立了檢測雛番鴨水禽細(xì)小病毒抗體的間接ELISA方法,為水禽細(xì)小病毒感染的診斷、免疫后抗體和母源抗體水平檢測以及基因工程疫苗的研究提供了一種簡便、靈敏診斷方法[7].張雅為對實驗免疫的鵝血清抗體進行檢測,結(jié)果表明,非結(jié)構(gòu)蛋白NS2的抗體最高峰較結(jié)構(gòu)蛋白VP3的早出現(xiàn)一周,選擇了GPV非結(jié)構(gòu)蛋白NS2作為檢測抗原,為使用重組結(jié)構(gòu)蛋白亞單位疫苗免疫動物時鑒別自然感染與疫苗免疫奠定了基礎(chǔ)[8].

2.3非結(jié)構(gòu)蛋白目前關(guān)于GPV非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein,NS)的報道不是很多,遠(yuǎn)不如結(jié)構(gòu)蛋白研究的豐富和深入.GPV的非結(jié)構(gòu)蛋白為LORF編碼的NS1和NS2,NS蛋白在GPV復(fù)制的早期產(chǎn)生,GPV NS蛋白的主要功能是負(fù)責(zé)病毒DNA的復(fù)制以及對基因表達(dá)的調(diào)控.NS2蛋白和NS1蛋白共同作用于細(xì)胞,產(chǎn)生對細(xì)胞有害的毒性,它的主要作用是協(xié)同、幫助NS1蛋白對細(xì)胞的毒性作用.孫敏華等克隆了鵝細(xì)小病毒佛山株的NS1基因,并將其克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-NS1,分析表明NS1蛋白得到了表達(dá),并且能與抗GPV的番鴨血清發(fā)生特異性反應(yīng)[9].邢明偉將NS2基因亞克隆于原核表達(dá)載體pGEX-6P-1,并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于感受態(tài)菌BL21(DE 3)plyS中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得重組NS2蛋白,發(fā)現(xiàn)其可以與GPV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)[10].

3　細(xì)小病毒細(xì)胞受體研究進展

病毒感染細(xì)胞的第一步就是吸附,病毒能與細(xì)胞吸附的關(guān)鍵就是要和細(xì)胞受體結(jié)合.研究病毒的細(xì)胞受體可以揭示病毒與宿主細(xì)胞之間的關(guān)系,了解病毒對各種宿主細(xì)胞嗜性,進入細(xì)胞的途徑機制以及對宿主敏感細(xì)胞的具體影響,還對了解病毒進入細(xì)胞后的復(fù)制動力學(xué)以及其他一些細(xì)胞內(nèi)事件,病毒的增殖與免疫機制相互的關(guān)系和作用提供一定參考[11-12].

李凌云等利用酵母雙雜交技術(shù)分別構(gòu)建了"獵物(prey)"蛋白表達(dá)載體和麻疹病毒VAP"誘餌(bait)"蛋白表達(dá)載體,然后共同轉(zhuǎn)化進入酵母菌細(xì)胞,利用已經(jīng)建立好的敏感細(xì)胞cDNA文庫進行篩選,得到了一個受體蛋白.董浩采用酵母雙雜交技術(shù)從鴨胚成纖維細(xì)胞的cDNA表達(dá)文庫中,篩選出GPV細(xì)胞結(jié)合蛋白,為闡明小鵝瘟致病、傳播和定植規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ),篩選到三個與VP1互作的蛋白,分別為核糖體蛋白S12,翻譯延伸因子EEF1A1以及一種未知蛋白,證實了鴨胚成纖維細(xì)胞的核糖體蛋白S12能夠與鵝細(xì)小病毒VP1蛋白相結(jié)合,為后續(xù)尋找能夠與核糖體蛋白互作的其他蛋白奠定基礎(chǔ).在此研究基礎(chǔ)之上,郭慧通過蛋白體外相互作用的GST Pull-Down技術(shù),驗證S12蛋白與小鵝瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的相互作用,結(jié)合產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠分析,結(jié)果證明S12與VP1能夠在體外進行結(jié)合,鴨胚成纖維細(xì)胞核糖體蛋白S12對GPV的增殖存在一定的抑制作用[13].

4　病毒的檢測方法

臨床上可根據(jù)病鵝的臨床癥狀和病理變化作出初步診斷,隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,小鵝瘟分子生物學(xué)診斷技術(shù)取得了很大的進展,由原來傳統(tǒng)的檢測技術(shù)受到發(fā)展為免疫學(xué)技術(shù)和高新分子生物學(xué)技術(shù)的方向快速發(fā)展,為當(dāng)前更有效防制GPV和對GPV進一步研究提供最新的技術(shù)保障.朱小麗將抗番鴨GPV單抗腹水采用透析法標(biāo)記異硫氰酸熒光素,制備成抗GPV熒光抗體,與間接熒光方法的符合率為92.9%,表明GPV熒光抗體具有較好的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性,可用于臨床快速診斷番鴨小鵝瘟病[14].劉飛成功地制作成了雙抗夾心法GPV膠體金免疫層析試紙條,在10～15 min內(nèi)可得到檢測結(jié)果,敏感度為104.1GELD50/0.2 mL,該試紙條特異性高,重復(fù)性好,可用于GPV的臨床快速診斷[15].

荊志強組裝膠體金免疫層析試紙條,并利用Point-of-care testing(POCT)scanner進行定量研究,制得的試紙條與瓊脂擴散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗相比,符合率分別為100%、97.7%,表明膠體金免疫層析技術(shù)正是一種簡易、快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)[16].饒桂波建立了PCR-DHPLC檢測方法是一種新的檢測GPV的方法,陽性檢出率達(dá)100%,是常規(guī)PCR方法的100倍,監(jiān)測和防制工作上升到新的水平[17].傅秋玲等建立了一種快速檢測鵝細(xì)小病毒的LAMP方法,且其檢測靈敏度達(dá)150 pg/μL,可見該方法為適合基層及現(xiàn)場快速檢測、實用靈敏的分子生物學(xué)方法[18].

5　鵝細(xì)小病毒免疫學(xué)研究

目前關(guān)于鵝細(xì)小病毒的免疫學(xué)方面的研究熱點主要包括活疫苗、滅活疫苗及基因工程疫苗的研制、單克隆抗體的研制與開發(fā)和抗原表位的研究等幾個方面.王倩用篩選出4株分泌抗GPV抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株,其中1G3和3B11雜交瘤細(xì)胞在體外具有穩(wěn)定分泌抗GPV單克隆抗體的能力,并對免疫后的抗體水平進行監(jiān)測,為鵝細(xì)小病毒病的疫情監(jiān)測和免疫抗體效價測定奠定基礎(chǔ)[19].盧菲等鵝細(xì)小病毒VP3基因疫苗與弱毒疫苗誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的比較,結(jié)果顯示,小鵝瘟VP3基因疫苗免疫小鼠的外周血T淋巴細(xì)胞對ConA刺激的反應(yīng),誘導(dǎo)的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞免疫功能和血清IgG抗體水平在不同時間段都顯著或極顯著高于弱毒疫苗免疫組[20].郭鷺利用Ni-NTA親和層析純化后的GPV VP3重組蛋白作為免疫原,通過Western Blot定位出兩個抗原表位為430～435 aa和643～647 aa[21].王娟對抗GPV單克隆抗體的抗原表位分析,結(jié)果顯示,在VP3基因的135～332 aa和322～535 aa處用間接免疫熒光檢測,并初步確定3E8株單抗的抗原表位在322～332 aa上[22].

6　展望

蛋白質(zhì)相互作用的研究,是揭示生物體正常生長發(fā)育及其應(yīng)對各種生物或非生物脅迫的分子機制重要途徑,深入研究小鵝瘟病毒的復(fù)制機理、揭示病毒結(jié)構(gòu)蛋白與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用,從蛋白質(zhì)水平闡明病毒侵染的過程,將會成為我們未來研究工作的重點;同時為了加強該病的流行監(jiān)測,進一步完善和建立及時、準(zhǔn)確、快速的檢測方法,是該病臨床診斷、防疫與檢疫的迫切要求,將有助于降低該病在家禽的流行;鵝細(xì)小病毒免疫學(xué)是研究鵝細(xì)小病毒工作的重要組成部分,研制基因工程活載體疫苗和DNA疫苗等新型疫苗也勢在必行;我國小鵝瘟研究工作雖然取得了一定的成果,但是目前的小鵝瘟防控仍舊存在問題,一些科學(xué)研究成果還沒得到應(yīng)用和推廣,需要研究工作者在小鵝瘟病毒方面的研究付出更多的努力.

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S852.65+9.2

A

0529-6005(2016)06-0063-03

2015-05-25

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20130522086JH);高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20112223110002);吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(201231);吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(2015209)

杜翔宇(1989-),女,碩士生,從事分子病原微生物與分子免疫學(xué)研究,E-mail:dxy1209@163.com

董浩,E-mail:donghao_jlau@163.com