劉寶山，張文奎，尹榮煥（沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽110866）

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恒溫解旋擴增技術(shù)的改進和發(fā)展

劉寶山，張文奎，尹榮煥
（沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽110866）

恒溫解旋擴增技術(shù)（Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）是紐英倫生物實驗室美籍華人KONG Hui-min于2004年發(fā)展建立的一種核酸等溫擴增技術(shù)[1]，它模仿生物體內(nèi)DNA的合成，在恒溫條件下（62℃或37℃）憑借解旋酶解開雙鏈DNA，然后引物與模板特異性結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下合成互補鏈，進行特異性基因的擴增[2]。

與普通PCR技術(shù)相比，HDA不需要昂貴的PCR儀，擴增在同一溫度下進行，無溫度變化時間間隔，反應時間明顯縮短，采用的聚合酶不易引起非特異性擴增，具有高度的敏感性，非常有利于在條件差的基層實驗室推廣應用，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的發(fā)展前景[3]。現(xiàn)在已有多種應用HAD進行疫病檢測的報道[4-6]。

然而，HDA技術(shù)也有擴增片段較短、只擴增DNA等一些不足，但人們在這些方面對其又進行了一系列的改進和研究，使其性能更加優(yōu)異，更符合臨床檢測的要求。

1　反應速度方面的改進

最初，HDA中經(jīng)常使用的是大腸桿菌UvrD解旋酶，其解鏈速度為20 bp/s，連續(xù)性為100 bp左右[7-8]，解鏈能力較低，使得HDA擴增序列的長度只有70～120 bp左右。這遠遠不能滿足人們基因擴增的要求，需要找到一種解鏈能力更強的解旋酶。2006年Yan Xu等發(fā)現(xiàn)了一種新的解旋酶（噬菌體T7基因4蛋白），其解鏈速度為300 bp/s，使得HDA擴增DNA的長度達到2.5 KB[9]，滿足了常規(guī)基因擴增和檢測的需要。

2008年Motre等通過使用一個卷曲螺旋連接頭將TteUvrD螺旋酶（Thermoanaerobacter tengcongensis UvrD helicase）和Bstpol聚合酶（Bacillus stearothermophilus DNA polymerase I Large Fragment）連接起來，構(gòu)建了一種融合酶helimerase，同時具有TteUvrD和Bstpol的活性；而且在恒溫解旋擴增反應中比單獨添加TteUvrD和Bstpol能合成更長的擴增片段[10]。

2　檢測模板方面的改進

2006年Yan Xu等在HDA的基礎(chǔ)上創(chuàng)建了一種可直接擴增完整環(huán)狀質(zhì)粒的環(huán)HDA法（The circular helicasede-pendent amplification，cHDA）[9]，讓基因擴增和篩選同步完成，不但可以用在分子生物學實驗中減少分析和構(gòu)建質(zhì)粒DNA的時間、提高產(chǎn)量，而且可以用于進行參與感染線形DNA的環(huán)狀DNA的檢測。而且，cHDA法的反應溫度為25℃，在室溫下就可進行，是一種實用的恒溫基因擴增方法。

為能夠擴增檢測RNA，2007年Goldmeyer等建立了反轉(zhuǎn)錄恒溫解旋擴增技術(shù)（isothermal reverse transcription-thermophilic helicase-dependent amplification，RT-tHDA），試驗表明，其具有很高的敏感性和特異性。通過添加一種特殊的熱穩(wěn)定的單鏈結(jié)合蛋白建立的一步RT-tHDA反應體系，可以在不到10分種的時間內(nèi)將埃博拉病毒（Ebola virus）的RNA擴增百萬倍[11]。

2011年Doseeva等報道了一種多重HDA，可以同時進行沙眼衣原體和淋病奈瑟球菌的擴增，顯示了很好的敏感性和特異性，并且可以對多種樣品和培養(yǎng)基進行擴增，這種方法非常適合臨床進行自動和高通量的檢測[12]。

3　HDA與其他技術(shù)的聯(lián)用

3.1HDA與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的聯(lián)用2007年，Gill等將恒溫解旋擴增技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)聯(lián)合起來，對幽門螺旋桿菌進行檢測。通過設(shè)計針對ureC的引物，使用異羥洋地黃毒苷配基（DIG）標記的等溫擴增程序?qū)毦腄NA進行了擴增。擴增產(chǎn)生的帶有DIG標簽的擴增產(chǎn)物熱變性后同特異性的生物素標記的DNA探針雜交，DNA探針以非共價鍵的方式被固定在抗生物素蛋白鏈菌素包被的微量滴定板上。然后使用HRP標記的抗DIG抗體以及底物進行了比色測定。來源于胃組織的樣本的測定結(jié)果同細菌培養(yǎng)相比分別具有90%和95.7%的敏感性和特異性。和其他的組織學研究相比分別具有96.6%和96.8%的敏感性和特異性[13]。2008年其又將納米金探針和HDA相結(jié)合建立了檢測幽門螺桿菌的方法，使用納米金標記的探針和HDA產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物雜交而形成的顏色使用比色法進行檢測[14]。這種方法可以在1 h內(nèi)最低檢測到10 CFU/mL的幽門螺桿菌，同細菌培養(yǎng)相比分別具有92.5%和95.4%的敏感性和特異性。和其他的組織學研究相比分別具有100%和98.8%的敏感性和特異性。這兩種方法操作都很容易，可以顯著地節(jié)省幽門螺桿菌檢測的時間和成本，在疾病的早期檢測中具有很大的潛力。

3.2HDA與微陣列技術(shù)的聯(lián)用為滿足快速、特異、敏感地進行多項目檢測的需要，2009年Andresen等發(fā)展了一種新的病原檢測方法-解旋酶依賴性的芯片擴增技術(shù)（helicase dependent OnChip amplification，OnChip-HDA），其將恒溫解旋擴增技術(shù)和微陣列進行結(jié)合，使基因分析和檢測整合在一個反應中，在多病原檢測中節(jié)省了時間和成本[15]。使用OnChip HDA方法對兩種病原-淋球菌和金黃色葡萄球菌的檢測證實了這些優(yōu)點。其在反應裝置上的簡易性以及集約化和多病原分析中的潛力使其在小型實驗室的芯片系統(tǒng)以及現(xiàn)場診斷中具有明顯的優(yōu)勢。2012年Frech，G C等將HDA和芯片雜交技術(shù)相結(jié)合檢測了鼻腔內(nèi)金黃色葡萄球菌的攜帶情況，結(jié)果和細菌分離相比整體的相對敏感性為89%，特異性為94%[16]。

3.3HDA與核酸提取技術(shù)的聯(lián)用2010年Mahalanabis報道了一種將核酸提取和HDA整合在一起的一次性檢測裝置[17]。在這個裝置中，細菌裂解、核酸提取和核酸擴增整合在一起組成一個筒形的聚合體，使用一個活門和一個疏水的聚四氟乙烯薄納米孔膜進行液體的控制，以熒光指示劑反映是否出現(xiàn)核酸擴增。這個裝置可減少使用者的多次操行，并且可以最低檢測到10個CFU的大腸桿菌。

3.4HDA與生物傳感器技術(shù)的聯(lián)用2011年Torres-Chavolla等還將DNA基的生物傳感器和tHDA結(jié)合起來用來檢測結(jié)核分枝桿菌，借助于便攜式的手提穩(wěn)壓器可應用于偏遠的實驗室[18]。

3.5HDA與電化學技術(shù)的聯(lián)用2011年Kivlehan等還報道了使用電化學方法進行HDA擴增結(jié)果的實時檢測，通過檢測嵌入了氧化還原電極的指示DNA的電流下降反應來檢測擴增結(jié)果。這種方法不但可以進行不足1h內(nèi)的目標核酸的定量分析，而且可以進行在擴增反應的終點進行DNA融解曲線的分析來區(qū)分特異性和非特異性擴增。這種檢測方法非常適合發(fā)展為一種簡單、確切、低廉并且高通量的檢測裝置，以取代更加復雜和昂貴的基于熒光的檢測方法[19]。

3.6HDA與蛋白質(zhì)技術(shù)的聯(lián)用2013年Cao，A等使用一個帶有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的發(fā)夾探針將蛋白信號轉(zhuǎn)換成DNA信號，借助核酸外切酶將多余的探針消化后進行HDA，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子的零背景信號擴增。該方法具有良好的特異性和靈敏度，能最低檢測到9.3×10-13M的轉(zhuǎn)錄因子，超過常用的檢測方法4個數(shù)量級[20]。

綜上所述可以看出，HDA作為一種新的恒溫基因擴增方法，具有自身獨特的優(yōu)點，通過與相關(guān)技術(shù)整合聯(lián)用，可以實現(xiàn)多種研究應用中的基因擴增，相信在不久的將來其必將得到廣泛的應用和發(fā)展。

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作者簡介：劉寶山（1975-），男，講師，博士，從事動物疫病的診斷和防治，E-mail：18698890218@163.com

收稿日期：2014-11-26

中圖分類號：S854.43

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0075- 02