楊德全，鞠厚斌，葛菲菲，劉 健，李 鑫，王 建，周錦萍

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

·綜述·

豬瘟病毒基因組遺傳變異研究進(jìn)展

楊德全，鞠厚斌，葛菲菲，劉 健，李 鑫，王 建，周錦萍

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

豬瘟 (classical swine fever，CSF ) 是由豬瘟病毒 ( Classical swine fever virus, CSFV ) 引起的一種高度接觸傳染性致死性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。本文概括了豬瘟病毒的基因分型，對(duì)豬瘟病毒與毒力相關(guān)基因進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，分析了病毒的遺傳變異特點(diǎn)，以期為豬瘟防控工作提供新思路。

豬瘟病毒；基因型；毒力；遺傳變異

豬瘟（classical swine fever, CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）感染豬引起的一種以高稽留熱、出血壞死和高死亡率等為主要特征的高度接觸性傳染病。目前，我國(guó)的 CSF 呈現(xiàn)典型與非典型共存、持續(xù)感染與隱性感染共存等新特征，并在臨床癥狀及病理變化上也出現(xiàn)了新變化，其流行特點(diǎn)及流行趨勢(shì)又出現(xiàn)新的特點(diǎn)，危害依然十分嚴(yán)重，尤其是 CSFV 的變異又給 CSF 防控提出了新的挑戰(zhàn)。因而，對(duì) CSFV 的分子生物學(xué)進(jìn)行研究，深入了解病毒的基因組結(jié)構(gòu)、功能和遺傳變異，對(duì) CSF 的防控具有重要意義。本文就 CSFV 基因組結(jié)構(gòu)、基因分型、毒力相關(guān)基因和遺傳變異特點(diǎn)等方面作一綜述，以期為CSF 防控工作提供新思路、新對(duì)策。

1　CSFV 基因結(jié)構(gòu)

CSFV 基因組為單股正鏈線狀 RNA 分子，長(zhǎng)度約 12．5 kb，5' 端無(wú)甲基化的帽子結(jié)構(gòu)，3' 端無(wú) poly（A）結(jié)構(gòu)。整個(gè)基因組由三個(gè)部分組成：兩端分別是 5' 非編碼區(qū)（5'-untranslated region, 5'-UTR）和 3' 非編碼區(qū)（3'-untranslated region, 3' -UTR），中間僅有一大的開(kāi)放閱讀框架（open reading frame, ORF），該 ORF 編碼一個(gè)由 3898 個(gè)氨基酸的多聚蛋白，在病毒和宿主細(xì)胞蛋白酶作用下，多聚蛋白在翻譯的同時(shí)被加工成各種成熟的結(jié)構(gòu)蛋白（C、Erns、El 和 E2蛋白）和非結(jié)構(gòu)蛋白（N pro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B蛋白）。從 N 端到 C 端依次：N pro、C、Erns、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B蛋白。

2　CSFV 的基因分型

CSFV 遺傳分型是追蹤 CSFV 傳播、變異以及持續(xù)性感染等極為有效的方法，有利于了解病毒的起源、分布和流行追蹤，為流行病學(xué)的研究和對(duì)該病的防控提供參考數(shù)據(jù)。1996 年 Lowings 等[1]率先對(duì)世界上 20 多個(gè)國(guó)家的 115 株 CSFV 進(jìn)行了序列比較、中和抗體反應(yīng)性及內(nèi)切酶分析后，將 115 株毒劃分成 2 個(gè)基因群。其中，基因Ⅰ群下屬 2 個(gè)亞群，包括 Alfortl87 株、Brescia 株、Thirverval 疫苗株以及20世紀(jì)60年代流行毒株；基因Ⅱ群下屬 3 個(gè)亞群，包括 Alfort 株和 20 世紀(jì) 90 年代的流行毒株。在此基礎(chǔ)上，Sakoda 等[2]1999 年通過(guò)對(duì) 40 余株流行毒的序列分析，將 CSFV 分為 3 個(gè)基因群：基因Ⅰ群以 Brescia 株為代表；基因Ⅱ群以 Alfort株為代表；基因Ⅲ群以日本、泰國(guó)和中國(guó)臺(tái)灣等地20 世紀(jì) 70 年代～ 90 年代的流行毒株為代表，與其他 2 個(gè)基因群差別較大。德國(guó)學(xué)者 Paton 等[3]對(duì)全球多個(gè)國(guó)家 400 余株 CSFV 5' -UTR 150 nt 區(qū)域、E2 基因 190 nt 區(qū)域及 NS5B 基因 409 nt 區(qū)域核苷酸序列比對(duì)分析后，將 CSFV 分為 3 個(gè)基因群即基因Ⅰ群、基因Ⅱ群和基因Ⅲ群。其中，基因 Ⅰ 和Ⅱ型有 3 個(gè)亞群（l．l、1．2、1．3亞型；2．1、2．2、2．3亞型），基因Ⅲ型則有 4 個(gè)亞群（3．1、3．2、3．3、3．4亞型）。Postel 等[4]2013 年報(bào)道古巴的新分離株與基因Ⅰ型其他亞群同源性相對(duì)較低，應(yīng)屬于新的亞群（l．4亞型）。目前，這一分型方法，基本涵蓋了所有己知的CSFV毒株，已成為國(guó)際公認(rèn)的分型標(biāo)準(zhǔn)。

我國(guó)開(kāi)展 CSFV 分子流行病學(xué)的研究工作較遲，近些年，已取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。2004年涂長(zhǎng)春[5]等對(duì)中國(guó)流行的 191 株流行株 E2 基因序列分析，顯示目前中國(guó)大陸流行的 CSFV 分為2個(gè)基因群，4個(gè)基因亞群，即 2．1、2．2、2．3 和 1．1 基因亞型。目前尚未發(fā)現(xiàn)基因Ⅲ群毒株，基因Ⅱ群在我國(guó)屬優(yōu)勢(shì)基因群，其中 2．1 和 2．2 基因亞群毒株是我國(guó)最主要的流行毒株。毛燕[6]對(duì)從廣西省1986 ～ 2011年收集的 77 株 CSFV 進(jìn)行 E2 基因序列分析，證明廣西 CSFV 主要屬于基因Ⅰ型中1．1亞群 和基因Ⅱ型中 2．1、2．2、2．3亞型，優(yōu)勢(shì)毒株為歐洲大陸的基因Ⅱ型中2．1亞型，仍未發(fā)現(xiàn)基因Ⅲ型。

由于 2．1 基因亞型存在較大的遺傳多樣性，進(jìn)而又將其分為 2．1a 和 2．1b 基因亞亞型[7,8]。2009 年中國(guó)大陸首次在陜西省分離到1株 2．1a 亞亞型毒株[9]，王海光[10]2011 ～ 2012 年采集河北省、河南省和山東省等地種豬場(chǎng)臨床健康豬的 400 份扁桃體，進(jìn)行檢測(cè)和病毒分離，分離到的11株病毒全部屬于2．1a 亞亞型。Chen等[11]對(duì) 2004 ～ 2007 年采集自我國(guó)華南地區(qū)的 35 份CSFV陽(yáng)性樣品調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中 34 份樣品為 2．1b 亞亞型，只有 1 份采集于 2004年的陽(yáng)性樣品為 2．2 亞型。Jiang 等[12,13]調(diào)查結(jié)果顯示在湖南省、廣西壯族自治區(qū)和廣東省等地區(qū)流行CSFV 2．1c 亞亞型的毒株。彭志成[14]對(duì) 2011 年來(lái)自廣東省 11 個(gè)城市的 57 株豬瘟病毒流行毒株 E2 主要抗原區(qū)域編碼基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明 57 株 CSFV 流行毒株中有 4 株基因型為 1．1 亞型，其它 53 株基因型均為 2．1 亞型，其中 2．1b 亞亞型 16 株，2．1c 亞亞型 31 株，2．1d 亞亞型 6 株。其中，2．1c和2．1d亞亞型毒株在廣東省屬首次報(bào)道，目前在該地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)2．1a毒株流行。Luo等[15]對(duì)2001～ 2009 年分離到的 31 株病毒的 E2 基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，11 株屬于 1．1 亞型，13 株屬于 2．1b 亞亞型，7 株屬于 2．1a 亞亞型。在已報(bào)道的 4 個(gè) CSFV 2．1 基因亞亞型 ( 2．1a ～ 2．1d ) 中，2．1b 亞亞型的流行范圍最廣[11,15]，為我國(guó)現(xiàn)階段的 CSFV 優(yōu)勢(shì)基因群，但 2．1c 亞亞群病毒 2011 年后有上升的流行趨勢(shì)[14]。隨著流行時(shí)間的推移，2．1c 亞亞型毒株有可能代替2．1b 成為我國(guó)優(yōu)勢(shì)豬瘟病毒流行毒株。

3　CSFV 的毒力相關(guān)基因

目前，已經(jīng)證實(shí) CSFV 的 7 個(gè)基因（Npro、C、Erns、E1、E2、P7、NS4B）與 CSFV 的毒力相關(guān)[16]。Npro 基因與 CSFV 的復(fù)制無(wú)關(guān)，而與毒力相關(guān)。Mayer 等[17]將中等毒力毒株與強(qiáng)毒株的 Npro 基因缺失，均可使毒力減弱，致弱后的病毒均能誘導(dǎo)機(jī)體生成相應(yīng)抗體并抵御強(qiáng)毒的攻擊。

Gladue 等[18]為研究C 蛋白與細(xì)胞 IQGAP1 蛋白結(jié)合是否對(duì)病毒毒力有影響，對(duì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ區(qū)進(jìn)行堿基替換后，發(fā)現(xiàn)病毒在原代巨噬細(xì)胞上呈現(xiàn)出缺陷生長(zhǎng)，體外對(duì)Ⅰ和Ⅲ 區(qū)堿基替換后，病毒的毒力完全減弱，這表明 C 蛋白與核內(nèi)蛋白質(zhì)IQGAP1 的相互作用對(duì)病毒的毒力相當(dāng)重要。

Sainz 等[19]研究表明 Erns 上 N 端的糖基化位點(diǎn)也會(huì)影響到 CSFV 的毒力，將 N269 用 A 或 Q 替換后會(huì)降低病毒的復(fù)制能力，毒力減弱。Tews 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，將 Erns RNase 活性區(qū)的 171Cys 突變，能夠抑制同源二聚體的形成，從而導(dǎo)致病毒毒力減弱。

Risatti 等[21]在 Brescia 強(qiáng)毒株 E1 基因羧基端插入一段 19 個(gè)氨基酸殘基的序列，獲得的突變株 RBC22V 在豬原代巨噬細(xì)胞上表現(xiàn)出正常的生長(zhǎng)特征，但將其接種豬后卻表現(xiàn)出毒力的顯著減弱，表明E1 蛋白羧基端區(qū)域與 CSFV 毒力有關(guān)。Fernandez-Sainz 等[22]利用點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變發(fā)現(xiàn)，N594、N513 或 N594、N500 的雙突變以及這三個(gè)糖基化位點(diǎn)的全部突變都會(huì)導(dǎo)致突變病毒不能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，突變除 N594 之外的任一或兩個(gè)糖基化位點(diǎn)后并不影響感染細(xì)胞中病毒粒子的形成和病毒的感染力，但是，如果單獨(dú)改變 N594 堿基或包含 N594 堿基在內(nèi)的任何 2 個(gè)堿基都會(huì)使病毒的毒力減弱。這表明 E1 蛋白的糖基化位點(diǎn)也與 CSFV 的毒力有關(guān)。

E2 基因有一個(gè) O-連接的糖基化位點(diǎn)和 6 個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)，這些糖基化位點(diǎn)均與病毒毒力有關(guān)，并且對(duì)豬體產(chǎn)生保護(hù)性抗體和亞單位疫苗的研制具有重要作用[23]。Risatti 等[24]應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，Asn805 的糖基化對(duì) CSFV 毒力影響最大，它的突變可導(dǎo)致病毒喪失毒力，在接種突變株后的d 3 和d 28可以抵抗致死性 BICv 毒株的攻擊，表明 CSFV E2 蛋白 N-連接糖基化影響病毒在豬體內(nèi)的毒力。此外，E2 蛋白上的抗原表位829TAVSPTTLR837 是影響豬瘟病毒毒力的重要位點(diǎn)[25]。Risatti 等[26]應(yīng)用反向遺傳技術(shù)用疫苗株 CS 毒株 E2 基因替換 Brescia 強(qiáng)毒株的 E2 基因，獲得的重組病毒株 Brescia-（E2-CS）對(duì)豬的毒力明顯下降，且在扁桃體內(nèi)的復(fù)制能力降低，僅表現(xiàn)一過(guò)性的病毒血癥。進(jìn)一步研究表明，CS 株和 Brescia 株的 E2 C 端 882～1064 區(qū)域中有 13 個(gè)氨基酸的變異，這些氨基酸對(duì)病毒毒力致弱起關(guān)鍵作用，單個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換對(duì)病毒毒力沒(méi)有影響，只有替換全部氨基酸才會(huì)導(dǎo)致病毒毒力減弱[27]。由此可見(jiàn)，E2 蛋白對(duì) CSFV 毒力影響很大。然而將編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因在 Brescia 株和 CS 株之間替換，獲得的重組病毒的毒力卻仍然保持著弱毒的特性，推斷出 E2 蛋白只是CSFV 毒力的一個(gè)組成因素，其他蛋白對(duì) CSFV的毒力也有影響。

Gladue 等[28]利用反向遺傳技術(shù)證實(shí)， P7 蛋白不僅對(duì)病毒在體外的繁殖起關(guān)鍵性作用，而且對(duì)病毒的毒力也有重要的作用。

NS4B 蛋白中有一個(gè)假定的 Toll/白介素-1 受體樣區(qū)域，該區(qū)域中有2個(gè)保守盒子區(qū)域（box1: 195IYKTYLSIRR204; box2: 228SVGIAVML235），這些保守區(qū)域的突變也能影響 CSFV 的毒力[29]。Tamura 等[30]對(duì) GPE（-）疫苗株的致弱機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn) NS4B 與 E2 蛋白在病毒的復(fù)制效率和致病性方面具有協(xié)同作用，其中 NS4B 的 V2475A和 A2563V 2 個(gè)氨基酸的替換在 GPE（-）疫苗株特性改變方面具有決定性的影響，結(jié)果表明NS4B 對(duì)病毒的毒力至關(guān)重要。

4　豬瘟病毒遺傳變異的特點(diǎn)

病毒的變異主要源于其基因組的突變和重組。豬瘟病毒基因組的突變主要集中在5' -UTR、3'-UTR、Erns、E2 和 NS5B 基因堿基序列的改變。根據(jù) CSFV 基因組的功能上看，5' -UTR 與 3' -UTR 主要與病毒的復(fù)制有關(guān)，并且在屬內(nèi)高度保守；NS5B是參與病毒復(fù)制的依賴(lài) RNA 的 RNA 聚合酶基因。Erns 和 E2 編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，能夠刺激抗體或中和抗體的產(chǎn)生，集中了 CSFV 的大部分主要抗原表位。朱妍等[31]分析比較了 22 株流行毒株、石門(mén)株和疫苗株之間的抗原性，發(fā)現(xiàn)流行毒株之間存在的抗原差異性主要反應(yīng)在 CSFV Erns 蛋白上，部分流行毒株發(fā)生了細(xì)微的抗原漂移?？乖砦坏钠瓶赡墚a(chǎn)生逃脫特定抗體中和作用的突變流行毒株，從而影響疫苗的免疫效果，甚至有可能導(dǎo)致疫苗免疫失敗。 E2 基因是 CSFV 全基因組中變異最大的部分，約為3．2%～25．0%[1]。趙耘等[32]對(duì) 22 株 CSFV E2 基因部分編碼序列的分析表明，我國(guó) CSFV 流行毒株向著遠(yuǎn)離疫苗株的方向變異，且呈現(xiàn)一定多樣性。目前我國(guó)的 CSFV 流行毒株在 E2 抗原基因上存在著較大的變異現(xiàn)象。E2 蛋白結(jié)構(gòu)的改變尤其是抗原表位的改變，可導(dǎo)致病毒逃脫抗體對(duì)它的識(shí)別，這是造成 CSFV 持續(xù)性感染的一個(gè)主要原因。

CSFV 重組可能改變 CSFV 毒力，并影響其遺傳進(jìn)化。賈琳等[33]對(duì) 50 株 CSFV 編碼區(qū)全基因組序列進(jìn)行選擇壓力和重組分析，結(jié)果顯示，選擇壓力共檢測(cè)出 14 個(gè)正選擇位點(diǎn)，分布于 Npro、Erns、E1、 E2 和 NS5A 蛋白，都與宿主免疫應(yīng)答有直接關(guān)系。重組分析的結(jié)果顯示，重組區(qū)域所涉及的基因組主要編碼與 CSFV 免疫和病毒毒力相關(guān)的蛋白，且重組的確改變了重組株所在的進(jìn)化樹(shù)分支；而蛋白 NS3、NS4A 和 NS4B 的編碼區(qū)均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)重組痕跡，其遺傳距離較短，進(jìn)化程度較低，這些結(jié)果表明重組可能改變 CSFV 毒力，并影響其遺傳進(jìn)化。另外，C 疫苗株能夠與流行毒株發(fā)生基因重組，從而產(chǎn)生新的未知特性的毒株[34]。當(dāng)前所用的豬瘟活疫苗仍能誘導(dǎo)良好的免疫保護(hù)，能夠抵抗不同基因型野毒的攻擊，但隨著時(shí)間的推移，CSFV 基因組突變的幅度將會(huì)加大，重組事件發(fā)生的頻率將會(huì)增強(qiáng)，常規(guī)豬瘟疫苗的免疫效果可能會(huì)令人堪憂(yōu)。因此，密切關(guān)注 CSFV 遺傳變異特點(diǎn)很有必要。

5　結(jié)語(yǔ)

CSF 是長(zhǎng)期以來(lái)困擾我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一，當(dāng)前，我國(guó) CSF 的流行特點(diǎn)及流行趨勢(shì)呈現(xiàn)出新的特點(diǎn)，危害依然嚴(yán)重，尤其是 CSFV 的變異又給 CSF 防控提出了新的挑戰(zhàn)。目前中國(guó)大陸流行的 CSFV 分為 2 個(gè)基因群， 4 個(gè)基因亞群，即 2．1、2．2、2．3 和 1．1 基因亞群，其中2．1b 亞亞型的流行范圍最廣，為我國(guó)現(xiàn)階段的 CSFV 優(yōu)勢(shì)基因群，但隨著流行時(shí)間的推移，2．1c 亞亞型毒株有可能代替 2．1b 成為我國(guó)優(yōu)勢(shì)豬瘟病毒流行毒株。同時(shí)，需警惕近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的2．1d 亞亞型毒株也有上升的趨勢(shì)。我國(guó)的 CSFV 流行毒株在 E2 抗原基因上存在著較大的變異現(xiàn)象。E2 蛋白結(jié)構(gòu)的改變尤其是抗原表位的改變，可導(dǎo)致病毒逃脫抗體對(duì)它的識(shí)別，這是造成 CSFV 持續(xù)性感染的一個(gè)主要原因。此外，CSFV 重組可能改變 CSFV 毒力，并影響其遺傳進(jìn)化。因此，了解和持續(xù)監(jiān)控 CSFV 的遺傳變異動(dòng)態(tài)，尤其應(yīng)密切關(guān)注E2 抗原基因的變異，將有助于對(duì) CSFV 感染和致病機(jī)制的深入化研究，為本病的有效防控乃至凈化提供切實(shí)可行的技術(shù)支撐。

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ADVANCE IN GENETIC VARIATION OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS

YANG De-quan, JU Hou-bin, GE Fei-fei, LIU Jian, LI Xin, WANG Jian, ZHOU Jin-ping
(Shanghai Animal Disease Control Center, Shanghai 201103, China)

Classical swine fever (CSF), a highly contagious and often fatal disease of pigs caused by the Classical swine fever virus (CSFV), can lead to important economic losses in the pig industry. In this review, we summarized the most recent knowledge of molecular features of the genome, proteome, genotyping as well as molecular basis of virulence and genetic variation of CSFV.

Classical swine fever virus; genotype; virulence; variation

S852.659.6

A

1674-6422（2016）05-0081-06

2016-01-18

上海市市級(jí)農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長(zhǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（滬農(nóng)青字（2015）第 2-6號(hào)）

楊德全，男，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物病毒分子生物學(xué)研究

周錦萍，E-mail: shzjpvet@163．com