戴建華，高 崧

（1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州225403；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州225300）

·綜述·

新城疫病毒反向遺傳技術(shù)的研究進(jìn)展

戴建華1，2，高 崧1

（1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州225403；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州225300）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）在分類上屬于副粘病毒科、副粘病毒屬（Avulavirus），是單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA病毒。反向遺傳技術(shù)是指從生物遺傳物質(zhì)DNA或RNA入手，通過對遺傳物質(zhì)進(jìn)行加工、修飾以及替換等，來研究基因突變后產(chǎn)生的生物學(xué)特性變化，從而確定生物體基因組的結(jié)構(gòu)與功能以及這些突變可能對生物學(xué)特性的影響。目前該技術(shù)已經(jīng)成為病毒學(xué)領(lǐng)域中研究基因功能的最有效方法。本文簡述了NDV反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建過程以及利用該技術(shù)在NDV研究中的最新成果。

新城疫病毒；反向遺傳；毒力；病毒載體

1　病毒概況

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）在分類上屬于副粘病毒科（Paramyxoviridae）副粘病毒屬（Avulavirus）中的成員，是單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA病毒［1］。目前NDV的核苷酸總數(shù)有3種長度，分別為15 186、15 192、15 198 nt。NDV的基因組結(jié)構(gòu)為3'-NP-P-M-F-HN-L- 5'，共編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，即核衣殼蛋白（nucleoprotein，NP）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、基質(zhì)蛋白（matrix protein， M）、融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase protein， HN）和RNA聚合酶蛋白（RNA-dependentRNA polymerase protein，L）。此外NDV的P基因轉(zhuǎn)錄過程中可在第484特定位置插入非模板G堿基發(fā)生RNA編輯現(xiàn)象，產(chǎn)生V和W兩種非結(jié)構(gòu)蛋白，位于囊膜上的F蛋白和HN蛋白是主要的保護(hù)性抗原［2，3］。

2　新城疫病毒反向遺傳技術(shù)

1999年Romer-Oberdorfer等［4］和Peeters等［5］所在的實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)表了新城疫病毒拯救成功的研究報道。到目前為止，許多不同基因型、不同毒力的毒株已被成功拯救。NDV的反向遺傳技術(shù)主要包括病毒基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建、NP、P和L基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定以及進(jìn)行質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染三部分。

2.1感染性cDNA克隆的構(gòu)建 構(gòu)建感染性cDNA克隆一般是通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分段擴(kuò)增RNA病毒基因組cDNA片段，然后利用人為設(shè)計或基因組中天然存在的特異性限制性酶切位點，將各個cDNA片段按病毒基因組順序依次克隆至低拷貝質(zhì)粒載體中，從而獲得病毒基因組全長cDNA感染性克隆?；蚪M3'端和5'端的克隆，大多采用cDNA末端快速擴(kuò)增法（rapid-amplification of cDNA ends，RACE）。由于高拷貝載體在復(fù)制過程中經(jīng)常出現(xiàn)插入片段的缺失或突變，為保證全長克隆構(gòu)建的成功率，大多采用復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)性較高的低拷貝載體。通常在低拷貝載體中還需加上一些必要的元件如T7啟動子、有自我剪接功能的丁肝核酶基因、轉(zhuǎn)錄終止信號和便于插入外源片段的多克隆位點等。將RT-PCR獲取的基因組cDNA按順序置于轉(zhuǎn)錄載體中的T7啟動子之后、丁肝病毒核酶基因和T7終止子之前，便完成了轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建［6-8］。2012年Li等［9］將I系苗Mukteswar的的全長序列置于CMV啟動子和牛生長激素（bovine growth hormone，BGH）的polyA之間，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染普通的BHK-21細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶II的作用下，產(chǎn)生具有精準(zhǔn)末端的反義基因組序列，同樣獲得了有感染性的病毒粒子，而且其拯救效率顯著高于T7啟動子。

所有的單股負(fù)鏈RNA病毒從cDNA克隆拯救感染性病毒的另一個重要環(huán)節(jié)是裝配功能性RNPs［10］。在NDV復(fù)制過程中，首先是病毒RNA聚合酶以核衣殼化的（-）ssRNA（RNPs）為模板，進(jìn)行各基因的轉(zhuǎn)錄。功能性RNPs形成需要NP、P和L蛋白的協(xié)同作用，可表達(dá)這3種蛋白的質(zhì)粒被稱作輔助質(zhì)粒。輔助質(zhì)粒構(gòu)建之后，通常采用微型基因組的方法來鑒定輔助質(zhì)粒是否具有正常的生物學(xué)功能。微型基因組保留病毒的順式作用元件和調(diào)控區(qū)（一般為病毒基因組兩端的非編碼區(qū)，non-coding region），在編碼區(qū)啟動子（如T7啟動子）下游反向引入SEAP 或GFP等報告基因，兩端為病毒復(fù)制所必需的病毒前導(dǎo)序列和尾隨序列等調(diào)控序列所構(gòu)成的cNDA克隆。因報告基因的插入方向與啟動子的轉(zhuǎn)錄方向相反，因此當(dāng)微型基因組轉(zhuǎn)錄成RNA后，只有在病毒輔助質(zhì)粒提供的輔助蛋白的作用下，才能生成反微型基因組意義鏈RNA，從而最終表達(dá)出報告基因蛋白。將微型基因組與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，微型基因組可在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，通過鑒定報告基因的表達(dá)即可衡量輔助質(zhì)粒的功能活性及所建立的拯救系統(tǒng)［11，12］。

2.2病毒的拯救 構(gòu)建好的3個輔助表達(dá)質(zhì)粒與含全長克隆的轉(zhuǎn)錄載體，一起共轉(zhuǎn)染已感染能表達(dá)T7 RNA聚合酶的痘病毒（vTF7-3、MVA-T7或FPV-T7）的普通細(xì)胞，或直接轉(zhuǎn)染能穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系，從而進(jìn)行病毒的拯救。但VV/T7系統(tǒng)也有局限性，VV的復(fù)制可能干擾被拯救病毒的產(chǎn)生，VV在感染時產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），最終會殺死細(xì)胞，因此外源基因表達(dá)并非一個連續(xù)過程，很可能外源病毒未被拯救，負(fù)載的細(xì)胞已經(jīng)破裂。目前仍不清楚VV表達(dá)的T7 RNA聚合酶是進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄重組質(zhì)粒，還是直接在細(xì)胞質(zhì)中起作用，研究人員普遍認(rèn)為T7 RNA聚合酶的“工作場所”是細(xì)胞質(zhì)。因此，許多學(xué)者尋求更為安全的替代系統(tǒng)，例如：構(gòu)建直接表達(dá)T7聚合酶的細(xì)胞系，它的應(yīng)用極大地方便了病毒的拯救，只需往此細(xì)胞系轉(zhuǎn)染含病毒基因組cDNA克隆和輔助表達(dá)質(zhì)粒就可以拯救出病毒，但是T7 RNA聚合酶的表達(dá)效率偏低［13，14］。

值得一提的是，Gao等［15］在基于T7 RNA聚合酶的平臺基礎(chǔ)上，開發(fā)出了一種更加容易操作的NDV拯救系統(tǒng)。他們將NDV 弱毒B1株的3個外部基因M、F、HN和外源GFP基因連入1個帶有T7啟動子的轉(zhuǎn)錄載體中。3個內(nèi)部基因NP、P、L和RFP連入另一個帶有同樣啟動子的轉(zhuǎn)錄載體。然后將這2個含有全長序列的轉(zhuǎn)錄載體和NP、P、L3個輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至表達(dá)有T7 RNA聚合酶的細(xì)胞中，結(jié)果拯救出了穩(wěn)定表達(dá)黃色熒光的NDV。重組病毒的生長特性與母本病毒一致，結(jié)果證明將NDV 的全長基因組分成兩個獨立的片段，再與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染也能夠完成感染性RNPs的組裝。副粘病毒病毒基因組比較龐大，構(gòu)建全長cDNA克隆需要分多次擴(kuò)增拼接，而且還容易引入突變造成病毒拯救失敗，如果能將病毒RNA分2個質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄，將大大簡化病毒拯救的流程和提高成功系數(shù)。

3　反向遺傳技術(shù)在NDV毒力研究的應(yīng)用

通過反向遺傳技術(shù)證實F基因的裂解位點是決定NDV毒力的主要因素［16，17］。目前研究人員更多的是聚焦于F基因裂解位點之外來尋找NDV毒力的分子基礎(chǔ)。HN蛋白是NDV的另一個囊膜糖蛋白，過去研究人員認(rèn)為其功能主要有兩個方面，蛋白中的血凝素部分負(fù)責(zé)病毒結(jié)合細(xì)胞的受體；神經(jīng)氨酸酶部分則將復(fù)制完畢后的子代病毒與宿主細(xì)胞裂解分開，其總體并不影響NDV的毒力［2］。隨著反向遺傳技術(shù)的出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)HN蛋白中的多個位點對毒力有顯著影響。2009年Khttar等［18］以中等毒力的BC株為骨架，在HN蛋白的保守區(qū)選擇了3個點進(jìn)行了突變。經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)526的Y變成Q后，病毒受體吸附能力，神經(jīng)氨酸酶活性以及毒力都大幅下降。2010年Yan等［19］通過反向遺傳平臺刪除HN基因的5'和3'的非翻譯區(qū)，發(fā)現(xiàn)缺失5'非翻譯區(qū)的病毒，其HN基因的mRNA表達(dá)水平和HN蛋白在病毒顆粒中含量都有所下降，并導(dǎo)致重組病毒對雞的致病力有顯著下降。結(jié)果表明HN基因的5'非翻譯區(qū)與病毒的致病力有顯著相關(guān)性。Qiu等［20］通過PCR突變的方法以VII型病毒ZJ1的感染性克隆為模板，構(gòu)建出了V蛋白缺失的病毒rZJ1-VS，并揭示了由于V蛋白功能喪失導(dǎo)致重組病毒不能有效降解磷酸化STAT-1，反而引起IFN-α的大量增加，使得病毒滴度降低進(jìn)而毒力下降。

長期以來一直認(rèn)為NDV的聚合酶蛋白不影響其毒力，但近期研究發(fā)現(xiàn)，聚合酶蛋白亦可顯著影響NDV的毒力。2008年Subrat等［21］分別以弱毒株La Sota和中等毒力的BC 株的感染性克隆為骨架，將兩者的L基因進(jìn)行替換，結(jié)果發(fā)現(xiàn)嵌合有BC株L基因的rLaSota BCL 致病力顯著增強(qiáng)，有力證明了L蛋白亦是NDV的決定因素之一。隨后Dortmans等［22］將1株鴿源NDV使用SPF雞連續(xù)傳代5次，將P5代病毒進(jìn)行全基因組測序發(fā)現(xiàn)其共有3個氨基酸的變化，2個位于L蛋白，1個位于P蛋白，此時P5代病毒的ICPI值已由親本株0.44上升至0.90。隨后他們構(gòu)建了親本株的感染性克隆，在此基礎(chǔ)上對上述3個點進(jìn)行了同樣的突變，比較后發(fā)現(xiàn)突變株較母本病毒在毒力方面有了顯著增強(qiáng)，而且在單層細(xì)胞上的空斑大小也有明顯變化。上述結(jié)果進(jìn)一步佐證了NDV的毒力不僅是由F0蛋白裂解位點決定，而是由多基因共同參與的結(jié)果。

4　反向遺傳技術(shù)在ND疫苗研制的應(yīng)用

通過新城疫病毒的反向遺傳平臺，人們可以在DNA水平上通過突變、替換、缺失、插入或互補(bǔ)等手段，來研究DVA的基因復(fù)制和表達(dá)、病毒蛋白與宿主的相互作用及抗病毒策略，進(jìn)而對各基因中特征性位點的具體生物學(xué)功能有進(jìn)一步的認(rèn)識。過去研究人員隨機(jī)依靠流行病學(xué)分離和人工誘變篩選疫苗候選株，現(xiàn)在通過反向遺傳技術(shù)可以針對性、方便地對病毒的遺傳信息進(jìn)行改造，拯救出用于不同目的NDV疫苗候選株，為更好地防制新城疫這個嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的烈性傳染病提供了新的保障。

4.1NDV新型疫苗 Peeters等［23］在已建立的NDV反向遺傳操作基礎(chǔ)上，將NDV LaSota株的HN基因用HN的胞漿區(qū)、跨膜區(qū)、基質(zhì)區(qū)和禽副粘病毒4型HN基因的免疫原性球狀區(qū)基因代替，構(gòu)建了含嵌合HN基因的NDV。重組的NDV失去血凝活性，但免疫4周齡SPF雞后用致死劑量NDV，攻擊重組NDV可完全保護(hù)SPF雞。所建立的這一方法可將NDV重組疫苗免疫動物與自然感染動物區(qū)分開來，這為預(yù)防ND的標(biāo)記疫苗的研制開發(fā)打下了很好的基礎(chǔ)。Mebatsion等［24］研究發(fā)現(xiàn)，NP蛋白447～455位氨基酸是一個免疫顯性表位，可以誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生針對該表位的抗體，而且這一區(qū)域的缺失并不影響病毒的增殖。根據(jù)這一特點，該研究組構(gòu)建了缺失NP蛋白443～460位氨基酸的NDV，免疫實驗動物后，受試動物不能產(chǎn)生針對此免疫顯性表位區(qū)的抗體，這一方法同樣可以將NDV疫苗免疫動物與自然感染動物區(qū)分開來。2009年Hu等［25］以VII強(qiáng)毒為骨架，通過PCR定點突變的方式，將其F0裂解位點突變?yōu)槿醵?，并進(jìn)行動物保護(hù)實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用當(dāng)前的VII流行毒株攻毒時，常用疫苗株LaSota雖能產(chǎn)生完全的臨床保護(hù)，但并不能防止流行株在免疫雞中的感染復(fù)制和排出。而使用VII型致弱疫苗株免疫組，不僅能提供理想的臨床保護(hù)，而且能顯著降低免疫雞的強(qiáng)毒感染率和排毒量，在臨床上可有效控制免疫雞群中非典型ND的發(fā)生。

4.2以NDV為載體雙價疫苗的最新研究進(jìn)展 2015年Wang等［26］將NDV強(qiáng)毒NA-1株通過反向遺傳平臺致弱后，以其為載體構(gòu)建了表達(dá)小鵝瘟病毒VP3基因的雙價基因工程疫苗。他們將小鵝瘟病毒的VP3基因插入NDV基因組中P～M基因之間，獲得了含有小鵝瘟病毒VP3基因的重組病毒rmNA-VP3。重組病毒雞胚連續(xù)傳10代后仍能穩(wěn)定地表達(dá)VP3蛋白。動物實驗顯示重組病毒免疫后對小鵝無致病性，并能同時檢測到針對NDV和小鵝瘟病毒VP3基因的高滴度抗體。Liu等［27］在2015年以NDV為載體，分別構(gòu)建了插入了H5和H7 亞型禽流感病毒HA基因的雙價活疫苗。插入前除在HA基因前添加GS和GE序列外，還在HA基因之后添加了NDV F基因胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)蛋白的編碼序列，并成功地拯救出了2株重組病毒。2株重組病毒免疫雛雞后，分別使用H7N9和H5N1的強(qiáng)毒攻擊，均能達(dá)到較高的保護(hù)率。Malli等［28］在2014年以NDV為載體構(gòu)建了分別表達(dá)雞喉氣管氣炎病毒gB、gC和gD基因的重組活疫苗。結(jié)果顯示gD基因的表達(dá)效率最高且能較好地嵌入至NDV的囊膜表面。動物實驗表明，免疫組能完全抵抗雞喉氣管氣強(qiáng)毒和NDV強(qiáng)毒的聯(lián)合攻擊。幾乎同時Zhao等［29］發(fā)表了以La Sota為骨架分別表達(dá)雞喉氣管氣病毒gB 和gD基因的相關(guān)文章。他們構(gòu)建的兩株重組病毒均能以較高水平表達(dá)外源基因，且重組病毒的毒力、生長曲線等與La Sota自身相比差異無顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。動物實驗表明，這兩株重組病毒可以通過噴霧和飲水的方式使用，且對兩種病毒都有較好的免疫保護(hù)效果。

綜上所述，NDV的反向遺傳技術(shù)已經(jīng)越來越成熟，伴隨著此項技術(shù)的成熟，不同特性的毒株被拯救，且對毒力的研究更加細(xì)致和全面。同時隨著反向遺傳學(xué)的快速發(fā)展，NDV作為疫苗載體有巨大的應(yīng)用意義。

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RESEARCH PROGRESS ON REVERSE GENETICS IN NEWCASTLE DISEASE VIRUS

DAI Jian-hua1，2， GAO Song1

（1. College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225403， China； 2. Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou 225300， China）

Newcastle disease virus （NDV） is an enveloped virus belonging to the genus Avulavirus within the family Paramyxoviridae which contains a single-stranded， negative-sense， non-segmented genome. Reverse genetics is an approach to discover the function of a gene by analyzing the phenotypic effects of specifi c engineered gene sequences. The advent of reverse genetics and molecular engineering of viruses have transformed the fi eld of virology by permitting study of targeted genetic changes in virus genomes. The technical progress in studying NDV virulence related genes by using the reverse genetic system was reviewed in the article.

Newcastle disease virus； reverse genetics； virulence； vector

S852.659.5

A

1674-6422（2016）04-0082-05

2016-03-16

國家自然科學(xué)基金青年基金（31400144）

戴建華，男，博士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

高菘，E-mail：gsong@yzu.edu.cn