杜翔宇，胡桂學，張?zhí)鹛?，董?

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，長春 130118； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長春 130118 )

病毒細胞受體研究技術及其應用現(xiàn)狀

杜翔宇1，胡桂學2，張?zhí)鹛?，董浩1*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，長春 130118； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長春 130118 )

病毒感染宿主細胞的過程實質是病毒受體與配體之間的相互作用。病毒受體和配體的研究是明確病毒致病機理的關鍵，因此關于病毒細胞受體的研究一直是近年來病毒學研究的重點領域。病毒受體的鑒定可通過多種生物技術手段進行，如酵母雙雜交法、病毒覆蓋蛋白結合技術等。文章對當前的病毒細胞受體研究技術及其應用現(xiàn)狀進行了綜述，以期為今后的相關研究提供參考。

病毒；細胞受體；生物技術；應用

近些年來，關于病毒細胞受體的研究一直是病毒學研究的領域。病毒細胞受體是病毒進入靶細胞的入口，細胞受體可以特異性的與病毒發(fā)生結合，然后介導病毒入侵。研究病毒的細胞受體可以揭示病毒與宿主細胞之間相互作用的關系，而且是明確病毒的致病機理的關鍵，同時可以為研究病毒的增殖與免疫機制之間的關系和作用提供參考依據(jù)，也可為開發(fā)靶向性強的抗病毒藥物和疫苗提供幫助。

所謂病毒的細胞受體，是指能被病毒的吸附蛋白所識別并與之發(fā)生特異性結合，介導病毒侵入細胞，啟動病毒感染的特殊性細胞表面位點。大多數(shù)病毒受體的本質是蛋白質，所以研究蛋白質相互作用的方法都可用于病毒細胞受體的研究。隨著研究技術的發(fā)展與進步，關于病毒細胞受體的研究也取得了進展，在不同程度上部分病毒受體的結構和功能得到了研究。鑒定病毒受體可通過生物技術手段進行，如酵母雙雜交法、病毒覆蓋蛋白結合技術、噬菌體表面展示技術、親和層析技術、串聯(lián)親和純化技術以及GST pull down技術等。本文對病毒細胞受體的研究技術及其應用現(xiàn)狀進行了綜述，以期為今后的相關研究提供參考。

1 酵母雙雜交法

酵母雙雜交法是研究活細胞體內(nèi)的蛋白質與蛋白質之間的相互作用的技術方法，其主要原理是利用酵母菌的生長轉錄因子GAL4含有的兩個結構域，DNA結構域(BD)及轉錄激活域(AD)，一個雜交蛋白為誘餌蛋白(X)與DNA結構域(BD)融合而成，另一個雜交蛋白為獵物蛋白(Y)與DNA轉錄激活域(AD)融合而成[1]。X和Y分別為誘餌蛋白獵物蛋白，通過篩選基因組文庫或 cDNA 文庫可以直接找到與誘餌蛋白相互作用蛋白的DNA 序列。

酵母雙雜交法是在迅速生長且易操作的酵母體系內(nèi)研究蛋白質之間的相互作用，現(xiàn)在許多研究已采用這種方法成功篩選了大量的互作蛋白。侯佩莉等通過酵母雙雜交篩選與流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白，PB1-F2各突變體均與宿主蛋白Gβ2發(fā)生相互作用，表明Gβ2和PB1-F2存在多個結合位點，也提示了G蛋白信號通路可能在流感病毒感染過程中發(fā)揮作用[2]。王維新利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的受體基因，共獲得兩個cDNA片段，為尋找WSSV的受體基因奠定了基礎[3]。高淑嫻將 JEV E 蛋白基因片段克隆到表達載體 pGBKT7 中，并轉化入酵母菌 AH109，獲得了以 JEV E 為誘餌蛋白的酵母雙雜交系統(tǒng)，研究結果表明獲得的流行性乙型腦炎 E蛋白、E蛋白的結構域Ⅲ以及以JEV的E蛋白為誘餌蛋白的酵母雙雜交系統(tǒng)可用于流行性乙型腦炎 E蛋白的結構與功能以及與其受體蛋白相互作用的研究[4]。胡淳玲利用酵母雙雜交方法研究麻疹病毒血凝素蛋白和H蛋白的相互作用，研究結果表明麻疹病毒血凝素蛋白分子上與H蛋白起關鍵作用的部位是N端27～135位氨基酸[5]。李鐵強利用酵母雙雜交系統(tǒng)從基因文庫中篩選與IBDV 弱毒株VP2蛋白相互作用的受體蛋白編碼基因，并通過間接免疫熒光實驗證明了兩個蛋白在活體內(nèi)存在相互作用[6]。

Timmusk等利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與PCV2、ORF1、ORF2、ORF3、ORF4相互作用的細胞蛋白，研究發(fā)現(xiàn)與ORF1 Rep蛋白相互作用的是中間絲狀蛋白和致癌基因[7]。Finsterbusch等分別用PCV1和PCV2、ORF1、ORF2作為誘餌蛋白，以豬脾細胞為靶細胞，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到與ORF2相互作用的鋅指蛋白，核小體裝配蛋白，前列腺細胞凋亡反應蛋白，核磷蛋白和熱休克蛋白[8]。

2 病毒覆蓋蛋白結合技術

病毒覆蓋蛋白結合法的關鍵在于病毒與受體可以進行特異性的結合，緊密依靠Western印跡技術，達到對病毒受體高效鑒別的目的。獲得病毒易感細胞表面的膜蛋白后，通過電泳技術對蛋白進行分離，使蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，然后用病毒液孵育，感作使其與受體相結合，能與病毒發(fā)生特異性結合的蛋白條帶則可以通過化學方法顯示。病毒覆蓋蛋白結合法主要優(yōu)點是靈敏度高，在實驗室中得到了廣泛的應用。

郭愛珍等應用病毒覆蓋蛋白結合法篩選犬瘟熱病毒(CDV)的細胞受體，結果找到了多個能與CDV相結合的細胞受體蛋白，一類是低分子量組蛋白，另一類是高分子量蛋白[9]。尹崇等利用病毒覆蓋蛋白結合法方法篩選斜紋夜蛾核多角體病毒的細胞受體并進行鑒定檢測，結果表明，在斜紋夜蛾腸敏感細胞總蛋白中找到了40 kD、73 kD、85 kD三種蛋白質可以作為受體與病毒相結合[10]。陸慧君以重組HEV S1 蛋白代替全病毒進行病毒覆蓋蛋白結合法，并成功獲得一條與 HEV-S1 蛋白特異結合的分子量為 90 kD 的蛋白條帶，推測此蛋白可能是 PK-15 細胞表面的 HEV受體，該受體的鑒定為進一步研究豬體原代細胞受體奠定了基礎[11]。

3 噬菌體表面展示技術

噬菌體表面展示技術是目前國內(nèi)外常用的一種基因表達篩選技術。以改造的噬菌體為載體，將外源蛋白基因與噬菌體衣殼蛋白基因整合到一起，噬菌體自我復制增殖裝配時，使外源基因隨衣殼蛋白一起表達，使外源多肽或蛋白質表達并展示于噬菌體表面，經(jīng)過篩選、感染、增殖過程后進行再篩選，然后將獲得的重組噬菌體外源基因片段插入序列并進行測序，通過進一步分析得到受體蛋白序列。

Tang等成功在T7噬菌體表面展示了乙肝病毒PreS1肽，進而研究PreS1肽基因進入肝癌細胞HepG2的可能性[12]。盧燕應用噬菌體表面展示技術從噬菌體隨機七肽庫中篩選轉鐵蛋白黏附肽，篩選獲得的4個TfB，有望于實現(xiàn)轉鐵蛋白與藥物的非共價連接，靶向治療疾病，同時也有利于以黏附Tf為策略的長效化蛋白質藥物的深入研究[13]。在對蝦白斑綜合癥的研究中袁麗采取噬菌體展示技術對病毒中和抗體及感染相關蛋白進行研究，篩選T7噬菌體展示的 WSSV cDNA 文庫，得到能與對蝦的細胞受體作用的 WSSV 定向靶蛋白，也就得到了該病毒感染相關基因[14]。何永剛應用噬菌體展示技術篩選Pres結合肽尋找乙型肝炎病毒特異性結合蛋白，構建了M13噬菌體P III蛋白融合的表面展示隨機肽文庫，并為研制抗乙肝病毒感染的新藥提供前導分子[15]。孫東波利用噬菌體展示技術初步確定PEDV S蛋白的第249～529位氨基酸區(qū)域(MRR)是豬氨基肽酶(pAPN)潛在的一個受體結合區(qū)域，這個研究結果將為PEDV S蛋白受體結合域進一步深入的研究提供信息[16]。

4 親和層析技術

親和層析的理論基礎是細胞膜的受體蛋白能夠與病毒本身的特異性配體結合，可以達到對細胞受體鑒定的目的。將病毒或者誘餌蛋白偶聯(lián)到Sepharose溶膠柱載體上，當?shù)鞍兹芤和ㄟ^層析柱時，其中可與親和載體配基相互作用的受體被吸附劑結合，而不被吸附的無關成分則流出柱體，而后利用高濃度的底物溶液或親和力更強的底物衍生溶液洗脫，使目標蛋白脫離層析柱上的載體。據(jù)此，Tallet等在獲取人體T細胞白血病病毒(HTLV-I)膜蛋白時，選擇了兩步親和層析與高濃度的鹽和非離子型的表面活性劑[17]；Maurer等獲得了牛病毒性腹瀉病毒的細胞受體CD46[18]。

5 串聯(lián)親和純化技術

串聯(lián)親和純化技術是近年發(fā)展起來的一種新的純化蛋白復合物的方法。利用一種特殊設計的蛋白標簽，重組構建帶有兩種純化親和標簽的融合靶蛋白，然后轉染到宿主細胞或組織，帶標簽的靶蛋白表達并結合上相關蛋白質后，利用標簽與相應磁珠作用，經(jīng)過兩步連續(xù)的親和純化，使得蛋白質復合物更接近天然狀態(tài)。

宋方麗通過串聯(lián)親和純化技術分離MCF-7-pCTAP-DNAJC12-V1細胞中的DNAJC12-V1蛋白復合體以及MCF-7-pCTAp-DNAJC12-V2細胞中DNAJC12-V1蛋白復合體，通過相互作用分析，得出MYH9與MRCL2間有直接的相互作用，因此DNAJC12可能通過調(diào)節(jié)MYH9蛋白的ATP酶活性來影響MYH9蛋白功能的發(fā)揮，研究均表明DNAJC12蛋白表達的改變在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[19]。Gloeckner 等使用 StrepⅡ/FLAG 標簽在 HEK293 鑒定了Raf 和其相互作用蛋白 MEK1 和 14-3-3，并且建立了該純化標簽使用標準流程[20]。劉俠聯(lián)合串聯(lián)親和純化技術和質譜鑒定乳腺癌細胞中LOX相互作用蛋白，即利用 StrepⅡ/FLAG 標簽純化富集 LOX 的復合體，經(jīng)過純化獲得LOX-SF重組蛋白復合物，質譜共鑒定到425個與LOX相互作用蛋白，可信度為95%[21]。江月等利用串聯(lián)親和純化技術篩選與腸病毒 71 型 3D 聚合酶相互作用的宿主細胞蛋白，結果表明Cyclin G1 僅在轉染重組質粒 pcDNA3.0-3D-Flag-HA的 RD 細胞免疫共沉淀復合物中檢測到，而在未轉染 pcDNA3.0-3D-Flag-HA 的 RD 細胞中未檢測到，3D聚合酶蛋白可能引起宿主細胞凋亡及細胞周期改變，還可能與炎癥反應及中樞神經(jīng)損傷有關[22]。馬培培釆用串聯(lián)親和層析方法篩選出了三個與豬嗜血支原體MSG1蛋白相互作用的紅細胞膜蛋白，切取蛋白條帶經(jīng)質譜分析鑒定這三種蛋白分別是豬乳鐵蛋白、帶三蛋白、肌動蛋白[23]。

6 GST-pull down技術

GST-pull down是在 GST 融合蛋白的基礎上發(fā)展起來的，利用基因重組技術構建含有GST標簽的重組載體進行原核表達，利用重組技術將誘餌蛋白與谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)融合，GST 親和純化柱進行蛋白純化獲得高純度的融合蛋白，再利用 GST 親和純化柱進行蛋白間的相互作用檢測，可以從中捕獲與之相互作用的目的蛋白，洗脫結合物后通過電泳分析，從而找到與靶蛋白相互作用的目的蛋白。

劉冬梅利用GST-pull down 聯(lián)合質譜鑒定 BAG 結構域相互作用蛋白，實驗結果證明在 Hela 細胞中鑒定到 370個潛在的能夠與BAG 結構域相互作用蛋白，主要為核糖體蛋白、翻譯起始因子、翻譯延長因子、泛素化-蛋白酶體相關蛋白及 HSP40 家族蛋白，其中BAG1 和核受體相互作用，使核受體調(diào)控細胞增殖和存活的能力增強，成為促進乳腺癌、前列腺癌等發(fā)生的一個重要原因[24]。侯佩莉利用GST pull down試驗從正反兩方向驗證了流感病毒PB1-F2與熱休克蛋白Hsp40相互作用，初步證實了流感病毒PB1-F2在體外能與Hsp40發(fā)生相互作用，將有助于揭示A型流感病毒的致病機理，從而為流感病毒感染的預防和治療提供參考[25]。

病毒與受體的相互作用是一個非常復雜的過程，并且病毒的受體可能不止一個，在今后的研究工作中如何將研究方法聯(lián)合使用，為病毒受體的研究提供更加精確和完善的鑒定方法，將成為研究的重點。另外，當前的研究方法都存在一定的缺陷，開發(fā)和探索更簡便、高效的方法將成為病毒受體的研究關鍵，同時對病毒細胞受體的相互作用機制研究也有待于進一步深入。

[1] Hamdi A, Colas P. Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery[J]. Trends in Pharmacological Sciences, 2012, 33(2): 109-118.

[2] 侯佩莉, 關振宏, 張茂林. GSTpull_down驗證流感病毒PB1-F2蛋白與熱休克蛋白40的相互作用[J]. 生物技術通報, 2011, 1:202-207.

[3] 王維新. 酵母雙雜交系統(tǒng)用于對蝦白斑綜合癥病毒W(wǎng)SSV受體基因的篩選[D]. 中國海洋大學,2004.

[4] 高淑嫻. 流行性乙型腦炎病毒 E 蛋白及其結構域Ⅲ的原核表達及酵母雙雜交系統(tǒng)的初步構建[D]. 第四軍醫(yī)大學, 2007.

[5] 胡淳玲. 麻疹病毒血凝素蛋白與受體的相互作用及麻疹病毒侵染機制研究[D]. 武漢大學, 2004.

[6] 李鐵強. 用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選IBDV弱毒株VP2蛋白CEF受體的初步研究[D]. 東北農(nóng)業(yè)大學, 2008.

[7] Timmusk S, Fossum C, Berg M. Porcine circovirus type 2 replicase binds the capsid protein and an intermediate filament-like protein[J]. J Gen Virol, 2006, 87(11): 3215-3323.

[8] Finsterbusch T, Steinfeldt T, Doberstein K,etal. Interaction of the replication proteins and the capsid protein of porcine circovirus type 1 and 2 with host proteins[J]. Virology, 2009b, 386(1): 122-131

[9] 郭愛珍, 陸承平. 犬瘟熱病毒細胞膜受體的鑒定[J]. 病毒學報, 2000, 16(2): 156-157.

[10]尹崇, 余健秀, 龐義. 斜紋夜蛾多角體病毒包埋型病毒受體的鑒定[J]. 中國病毒學, 2002, 17(1): 66-68.

[11]陸慧君. 豬血凝性腦脊髓炎病毒的分離鑒定及其受體的篩選[D]. 吉林大學, 2008.

[12]Tang K H, Yusoff K, Tan W S. Display of hepatitis B virus PreS1 peptide on bacteriophage T7 and its potential in gene delivery into Hep G2 cells[J]. Virol Meth, 2009, 159(2): 194-199.

[13]盧燕. 利用噬菌體表面展示技術篩選轉鐵蛋白特異性黏附肽的研究[D]. 大連工業(yè)大學, 2010.

[14]袁麗. 應用噬菌體展示技術對對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)中和抗體及感染相關蛋白的研究[D]. 中國科學院, 2006.

[15]何永剛.應用噬菌體展示技術篩選Pres結合肽尋找乙型肝炎病毒特異性結合蛋白[D]. 蘭州大學, 2006.

[16]孫東波. 豬流行性腹瀉病毒S蛋白抗原表位鑒定及受體結合域的初步篩選[D]. 中國農(nóng)業(yè)科學院, 2010.

[17]Tallet B, Astier-Gin T, Londos-Gagliardi D,etal. Expression purification and biological properties of the carboxyl half part of the HTLV-I surface envelope glycoprotein[J]. Chroma togr B Biomed Sci Appl, 2000, 737(1/2): 85-95.

[18]Maurer K, Krey T, Moennig V,etal. CD46 is a cellular receptor for bovine viral diarrhea virus[J]. Virology， 2004, 78(4): 1792-1799.

[19]宋方麗. 串聯(lián)親和純化技術聯(lián)合質譜技術對對DNAJC12兩種剪切體相互作用蛋白的鑒定[D]. 南方醫(yī)科大學, 2010.

[20]Gloeckner C J, K Boldt, A Schumacher,etal. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP tag[J]. Methods Mol Biol, 2009, 564: 359-372.

[21]劉俠. 串聯(lián)親和純化技術聯(lián)合質譜鑒定乳腺癌細胞中LOX相互作用蛋白[D]. 廣西醫(yī)科大學, 2014.

[22]江月, 叢浩龍, 王健. 串聯(lián)親和純化技術篩選腸病毒71型3D聚合酶的相互作用蛋白[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2012, 34(6): 526-529.

[23]馬培培. 豬嗜血支原體MSG1蛋白與豬紅細胞膜蛋白相互作用的研究[D]. 南京農(nóng)業(yè)大學, 2013.

[24]劉冬梅. GSTpull_down聯(lián)合質譜鑒定BAG結構域相互作用蛋白[J]. 中國生物工程雜志, 2015, 35(4) : 1-10.

[25]侯佩莉. 酵母雙雜交篩選流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白[D]. 吉林農(nóng)業(yè)大學, 2011.

(編輯：李文平)

Application Status of Research Techniques of Virus Receptors

DU Xiang-yu1，HU Gui-xue2，ZHANG Tian-tian1，DONG Hao1*

(1.CollegeofLifeScience,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

Virus infecting the cellular receptors is the essence of interaction between virus receptor and the ligand. Virus receptors and ligands researches have been regarded as the key points for clearing the virus pathogenic mechanism, so the researches of virus cell receptors have been became the important virology research field in recent years. The biological technologies could be used to identify virus receptors, such as yeast two hybrid methods, virus overlay protein binding assay, etc. The application status of the research techniques of virus cell receptors were summarized in this paper in order to provide reference for the future related research.

virus; cellular receptor; biological technologies; application

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20130522086JH)；吉林省教育廳科學技術研究項目(2015209)

杜翔宇，碩士研究生，從事分子病原微生物與分子免疫學研究。

董浩。E-mail：donghao_jlau@163.com

2015-12-04

A

1002-1280 (2016) 02-0063-04

Q81