莊金秋，張 穎，梅建國，2，莊夕棟，李 峰，楊麗梅

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司，山東 濱州 256600；3.諸城市畜牧獸醫(yī)管理局，山東 諸城 262200）

豬細(xì)環(huán)病毒檢測方法研究進(jìn)展

莊金秋1，張 穎1，梅建國1，2，莊夕棟3，李 峰1，楊麗梅1

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司，山東 濱州 256600；3.諸城市畜牧獸醫(yī)管理局，山東 諸城 262200）

豬細(xì)環(huán)病毒（TTSuV）是近年來新發(fā)現(xiàn)的DNA病毒，在世界豬群中廣泛存在，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，而且有潛在跨物種傳播給人類的可能性，引起了養(yǎng)豬業(yè)的極大關(guān)注。通過綜述TTSuV近年來檢測方法研究進(jìn)展，以期對科研工作者和廣大養(yǎng)殖業(yè)主更好地防治該病提供參考。

豬細(xì)環(huán)病毒；檢測；PCR；研究進(jìn)展

豬細(xì)環(huán)病毒（Torque teno sus virus，TTSuV）屬于細(xì)環(huán)病毒科壬型細(xì)環(huán)病毒屬成員，為無囊膜的單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒。細(xì)環(huán)病毒（Torque teno virus，TTV）又稱為輸血傳播病毒，是由日本學(xué)者Nishizawa等在1997年運(yùn)用代表性差異分析（RDA）技術(shù)從一例輸血后肝炎患者血清中首次發(fā)現(xiàn)的一種新病毒。TTV宿主范圍非常廣泛，包括靈長類動物中的人、黑猩猩和猴，家畜中的豬、牛、羊、犬、貓、雞以及其他動物，如鼠和駱駝等。TTSuV是由美國學(xué)者Leary等于1999年利用巢式PCR（nPCR）從豬血清中首次檢測到的。人源TTV至少可分為21個基因型，豬源TTSuV有2個基因型，分別為TTSuV1和TTSuV2，其核苷酸同源性僅為44%。不同年齡段的豬群均對TTSuV易感，我國豬群感染率大致在24%～100%。TTSuV傳播途徑廣泛，可以通過糞-口傳播、垂直傳播、疫苗注射等途徑進(jìn)行傳播。雖然TTSuV傳播方式多樣，臨床陽性檢出率也很高，但是目前還沒有其單獨(dú)導(dǎo)致豬致病的報(bào)道。迄今TTSuV的致病性尚不明確，目前研究只了解到其與豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等病毒存在某種協(xié)同作用，當(dāng)發(fā)生混合感染時會加重?cái)嗄套胸i多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的癥狀，使病情加重，特別是對斷奶仔豬造成嚴(yán)重危害，威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，而且有潛在跨物種傳播給人類的可能性，引起了養(yǎng)豬業(yè)的極大關(guān)注。

1　病毒分離鑒定

1.1 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)

目前尚未找到合適的細(xì)胞系適于TTSuV的分離和培養(yǎng)，也沒有合適的動物模型來研究該病毒。有很多學(xué)者已致力于病毒增殖的研究。Huang等構(gòu)建TTSuV2感染性分子克隆轉(zhuǎn)染傳代系豬腎細(xì)胞（PK-15）、豬睪丸細(xì)胞（ST）和293T細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，TTSuV2在這些細(xì)胞中能夠復(fù)制，但是復(fù)制水平很低。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞連續(xù)傳代20代后不能繼續(xù)傳代。

1.2 直接電鏡觀察

Yukio等［1］通過免疫電鏡首次觀察到了人源TTV的球狀病毒粒子形態(tài)，直徑約為30～32 nm。劉建波等利用負(fù)染法在電鏡下首次觀測到了TTSuV1病毒粒子。

2　血清學(xué)方法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

Huang等［2］首次利用大腸桿菌（E.coli）原核表達(dá)了TTSuV2衣殼蛋白，建立了TTSuV2的蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）血清學(xué)診斷方法，用于檢測豬血清中TTSuV2抗體。張龍等［3］成功制備了抗TTSuV1 Cap蛋白單克隆抗體，為TTSuV1檢測方法的建立和抗原表位的鑒定奠定了基礎(chǔ)。Jarosova等［4］建立了間接ELISA方法對豬血清進(jìn)行TTSuV兩種基因型的檢測，結(jié)果豬血清中TTSuV1和TTSuV2的陽性率分別為78%和88%。李淞［5］建立了快速檢測TTSuV2 ORF1抗體的間接阻斷ELISA方法。為TTSuV2感染的有效監(jiān)測提供了技術(shù)支持。劉建波［6］、劉芊麟等先后以截短的TTSuV1 Cap融合蛋白為包被抗原，建立了檢測TTSuV1抗體的間接ELISA方法。應(yīng)用該法對北京、天津、河北3個地區(qū)規(guī)?；i場的89份血清樣本的檢測結(jié)果顯示，3地區(qū)的豬場的TTSuV1抗89.9%，表明我國京津冀存在很高的TTSuV1感染純化的重組蛋白作為包被檢測TTSuV2的間接ELI用該方法對采自江西3家84份血清樣品進(jìn)行檢測，別為72%、57.5%、36.3%?；i場存在較高TTSuV

3　分子生物學(xué)方法

3.1 PCR

PCR是目前檢測TTSuV最常用、有效的方法。國內(nèi)外學(xué)者根據(jù)GenBank上登錄的TTSuV基因組序列設(shè)計(jì)一系列引物，建立了諸多PCR檢測方法，用于TTSuV的流行病學(xué)調(diào)查。Segalés等［8］建立了檢測TTSuV的PCR方法，對1985—2005年間的162份病料樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果TTSuV1陽性率為33.3%，TTSuV2陽性率為55.6%，TTSuV1和TTSuV2共感染率為23.5%。將TTSuV感染豬的時間可追溯到1985年，為TTSuV對動物的感染留下了最早的證據(jù)。翟少倫等［9］用PCR方法檢測了我國9個省市的191份血液樣品和組織樣品，結(jié)果TTSuV的總陽性率為77.0%，TTSuV1的單一陽性率為68.6%，TTSuV2的單一陽性率為53.9%，兩種病毒的混合感染率為45.5%。隨后對41份健康豬的血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，TTSuV總陽性率、TTSuV1單一陽性率、TTSuV2單一陽性率及兩種病毒的共感染率分別為43.9%、36.6%、24.4%和12.2%。 在臨床健康的豬體內(nèi)存在該病毒，表明豬可能是TTSuV的儲存宿主。婁高明等、王礞礞、南文金等［10］分別建立了TTSuV1和TTSuV2的PCR方法，對采自華南地區(qū)的豬病料進(jìn)行檢測，表明在我國華南豬群中TTSuV的感染較為普遍。鄒力［11］應(yīng)用建立的PCR檢測方法對從四川部分地區(qū)所采集的254份血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明四川地區(qū)豬群中TTSuV感染普遍存在，且TTSuV2感染率更高，為整個西南地區(qū)豬TTSuV流行病學(xué)調(diào)查提供了數(shù)據(jù)支持。夏應(yīng)菊等對我國29個省市豬場采集的1 898份豬血清樣品同時進(jìn)行PCV2和TTSuV的PCR檢測，結(jié)果表明我國豬群中TTSuV和PCV2混合感染現(xiàn)象較為普遍。張志成等采用PCR對來自江蘇地區(qū)6個豬場的398份血清樣品進(jìn)行TTSuV檢測，結(jié)果表明TTSuV感染在江蘇地區(qū)豬群中普遍存在，并對我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)構(gòu)成潛在威脅。李海超等應(yīng)用PCR方法對采自山東、福建、安徽、河北、河南、廣西、遼寧和湖北八省份的227份樣品進(jìn)行PCV2、TTSuV1和TTSuV2的檢測。結(jié)果表明上述省份的豬群中普遍存在PCV2和TTSuV的混合感染。張青占等［12］采用PCR對2011—2012年期間從江蘇、安徽、天津、湖北、上海、浙江6個省份共采集的無明顯臨床癥狀的豬血清488份和發(fā)病豬群樣品352份進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在無明顯臨床癥狀的豬血清中，TTSuV1和TTSuV2感染率分別為41%和67%，二者混合感染率為28%。PMWS發(fā)病豬樣品中PCV2陽性率高達(dá)75%，PCV2和TTSuV2的混合感染高達(dá)61%。在PRRSV為陽性的病料中，TTSuV2的陽性率高達(dá)86%。在初產(chǎn)母豬和流產(chǎn)胎兒中，TTSuV1和TTSuV2的感染率，以及與不同病毒的混合感染率均高于健康豬群的感染率。這些研究為豬源TTSuV提供了流行病學(xué)資料，也為研究混合感染的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

3.2 套式PCR

套式PCR又稱巢式PCR（Nested PCR）。套式PCR反應(yīng)過程中需要使用兩對引物并經(jīng)過兩輪擴(kuò)增，其敏感性和特異性均優(yōu)于普通PCR。Mckeown等根據(jù)TTSuV非編碼區(qū)設(shè)計(jì)一對套式PCR引物，對6個國家豬群中感染情況進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示TTSuV陽性率為66.2%（102/154）。Martinez等用巢式PCR方法對歐洲野豬感染TTSuV檢測，結(jié)果表明TTSuV1在歐洲野豬群中的流行率為58%、TTSuV2流行率為66%。Kekarainen等采用巢式PCR方法對豬血清和精液進(jìn)行TTSuV檢測，結(jié)果表明血清中TTSuV感染率為74%、精液中為72%，精液中TTSuV的高檢出率顯示TTSuV可能通過性途徑傳播。Pozzuto等［13］采用巢式PCR對母豬和仔豬TTSuV感染情況進(jìn)行檢測，表明TTSuV可以垂直傳播，胎兒感染率很高。王礞礞等［14］用巢式PCR方法檢測了廣東、福建、江西等7個省的280份血液樣品和組織樣品，首次證實(shí)了我國豬群中存在TTSuV感染，且TTSuV1 和TTSuV2的單一陽性檢出率分別為37.6%和82.6%，混合陽性檢出率為34.5%。洪紹鋒等［15］采用巢式PCR方法對廣西不同豬場的95份血液樣品和組織樣品進(jìn)行了TTSuV檢測，結(jié)果顯示，TTSuV1的陽性率為37.9%，TTSuV2的陽性率為20.0%，表明廣西部分地區(qū)豬群確實(shí)存在TTSuV的感染。韋建興等［16］應(yīng)用巢式PCR方法，對2009—2011年采自廣西140個規(guī)模豬場的156份血液、流產(chǎn)胎兒及肺臟、脾臟、腎臟、肝臟、淋巴結(jié)等組織樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，廣西豬群中TTSuV總感染率達(dá)到93.6%，TTSuV2的感染率（76.9%）明顯高于TTSuV1（16.7%）。TTSuV多與PCV2和PRRSV混合感染。李坤等［17］、田光玲［18］先后根據(jù)TTSuV保守結(jié)構(gòu)UTR序列設(shè)計(jì)引物建立了巢式PCR方法。應(yīng)用該法對從江西南昌、宜春、贛州等8個地區(qū)不同豬場采集的183份血液樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示TTSuV1的感染率為40.4%，TTSuV2的感染率為68.9%，TTSuV1 和TTSuV2混合感染率為30.1%。這些研究為我國開展TTSuV的流行病學(xué)調(diào)查及相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

3.3 熒光定量PCR

鑒于普通PCR和套式PCR只能從定性方面來檢測TTSuV，而不能從量的方面來確定病毒的載量，研究者建立了實(shí)時熒光定量PCR（QRT-PCR）方法用來檢測TTSuV。Anddreas等根據(jù)TTSuV基因組在非編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針建立探針法熒光定量PCR，對203份豬血清樣品進(jìn)行了TTSuV檢測，結(jié)果顯示，TTSuV1、TTSuV2單獨(dú)感染率分別為32%和17%，二者混合感染率為32%。陳欣等［19］根據(jù)TTSuV UTR保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)了兩對特異性引物，建立了SYBR Green I二重?zé)晒舛縋CR方法，最低檢出量為10copies/mL。王俊等［20］、單晶晶等［21］先后建立了TTSuV1和TTSuV2 SYBR Green I實(shí)時定量PCR方法，用于TTSuV兩型的檢測和定量分析。

3.4 高效液相色譜法

DHPLC全稱變性高效液相色譜分析。RCR反應(yīng)擴(kuò)增后結(jié)合DHPLC技術(shù)可同時分析數(shù)百個樣品，且可省去瓊脂糖電泳的步驟，更加省時簡便。楊春華等［22］建立了檢測TTSuV1 和TTSuV2的高效液相色譜法（PCRDHPLC）技術(shù)，對從江西5個規(guī)?；i場采集的80血清樣品分別進(jìn)行PCRDHPLC、熒光PCR和PCR檢測，結(jié)果顯示PCR-DHPLC和熒光PCR陽性檢出率相當(dāng)，高于PCR法。應(yīng)用PCRDHPLC技術(shù)可對TTSuV感染豬進(jìn)行早期、快速檢測及病原流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)時監(jiān)測，同時也為研究TTSuV在豬體內(nèi)的感染及分布提供了新的檢測技術(shù)。

3.5 反向PCR

反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知核苷酸序列，Huang等［23］首次利用反向PCR方法擴(kuò)增出TTSuV全長序列，證明豬群中可能普遍存在不同亞型的TTSuV混合感染。

3.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

向海洋等運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)針對TTSuV1的UTR設(shè)計(jì)了LAMP引物，建立了TTSuV1的檢測方法，檢測靈敏度可達(dá)5.5 copies/μL。張黎也以TTSuV UTR和ORF1前端區(qū)域?yàn)榘行蛄校群蠼⒘藱z測TTSuV1和TTSuV2的LAMP方法。LAMP方法的建立為快速及特異性的檢測豬TTSuV提供了有效的方法，為TTSuV的早期快速診斷和流行病學(xué)監(jiān)測提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段。

3.7 限制性片段長度多態(tài)性分析

限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）技術(shù)是分子生物學(xué)重要分析方法的一種，用于檢測DNA序列多態(tài)性。PCR-RFLP技術(shù)融合了PCR、RFLP分析和凝膠電泳方法，先通過PCR技術(shù)完成對靶序列的克隆，后續(xù)用不同限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，最后依據(jù)凝膠電泳結(jié)果而分型。Irshd等根據(jù)TTSuV2 ORF2中相對保守的區(qū)域設(shè)計(jì)了特異性引物，運(yùn)用RFLP技術(shù)對印度豬群中TTSuV流行情況進(jìn)行了調(diào)查。

4　小結(jié)

綜上所述，TTSuV和PCV2在豬群中共同感染廣泛存在，傳播途徑廣泛，危害性不容忽視，因此加強(qiáng)其流行病學(xué)和致病機(jī)理研究具有重要意義。自TTSuV發(fā)現(xiàn)以來，科研工作者進(jìn)行了大量的流行病學(xué)研究，但由于病毒異質(zhì)性強(qiáng)和共感染率高，很難得到單一基因型的純培養(yǎng)物，而且病毒沒有單一的嗜性靶器官，幾乎所有組織臟器均有分布，這使得病毒分離非常困難，至今尚未建立起培養(yǎng)病毒合適的細(xì)胞系，這極大地限制了人們對TTSuV致病機(jī)制的深入研究。目前建立的血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)和實(shí)用性，臨床上需要根據(jù)不同的場合、條件等選擇使用其中的一種或者多種方法。雖然上述檢測方法為TTSuV的檢測提供了有效的技術(shù)手段，但是隨著人們對TTSuV的深入研究，相信檢測技術(shù)將更加簡便化、快速化和準(zhǔn)確化，這必將對疾病的有效防控產(chǎn)品及技術(shù)的研制奠定基礎(chǔ)。

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2016-06-07）

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-08-17）

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，獸醫(yī)碩士，副研究員，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動物用病毒疫苗研制。