鞠 杰 劉煥彩 王巧真 劉永新 王 箐 張雅雯 周風(fēng)華 陳燕春

(濰坊醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 濰坊 261053)

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自噬與骨肉瘤研究進(jìn)展

鞠 杰 劉煥彩1王巧真2劉永新2王 箐2張雅雯 周風(fēng)華2陳燕春2

(濰坊醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 濰坊 261053)

自噬；骨肉瘤；自噬相關(guān)因子

骨肉瘤是一種骨髓間充質(zhì)來源的原發(fā)性惡性骨腫瘤，通常發(fā)生在長骨干骺端和膝關(guān)節(jié)周圍，主要發(fā)生在青少年時(shí)期，成人呈現(xiàn)雙峰年齡分布。通常采取多種方式聯(lián)合治療，包括輔助化療、截肢與保肢重建手術(shù)?；熉?lián)合手術(shù)治療能夠極大提高生存率，然而超過80%的手術(shù)治療患者表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移〔1〕，患者預(yù)后極差。此外，化療所帶來的毒性和副作用嚴(yán)重影響了患者的治療效果。當(dāng)前自噬上調(diào)被發(fā)現(xiàn)存在于多種腫瘤疾病中，降低自噬可限制腫瘤生長〔2〕。因此，如何抑制骨肉瘤發(fā)展并降低治療過程的毒副作用是一個(gè)亟待解決的問題。自噬是一個(gè)受到嚴(yán)格監(jiān)管的溶酶體降解途徑，在所有物種中高度保守。自噬能防止有害元件的蓄積，降解或者回收部分損傷細(xì)胞器及其他細(xì)胞產(chǎn)品，以保持細(xì)胞正常生長和分裂分化，維持代謝平衡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性〔3〕。研究表明，自噬基因的缺陷，增加了基因組不穩(wěn)定性、喪失移除受損線粒體的能力進(jìn)而產(chǎn)生活性氧，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生〔4〕。抑制自噬可提高目前使用的抗腫瘤藥物及其他療法的有效性〔5〕。本文將對(duì)自噬及自噬相關(guān)因子與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系做以下綜述。

1 高遷移率族蛋白(HMGB)1調(diào)節(jié)自噬

1.1 HMGB1 HMGB1是結(jié)合于染色質(zhì)胞外損傷有關(guān)的模式分子，是一種重要的自噬調(diào)節(jié)物質(zhì)〔6〕。人類的HMGB1 有215 452個(gè)氨基酸殘基組成，形成2個(gè)DNA結(jié)合域和1個(gè)C末端酸性尾巴。HMGB1在細(xì)胞核中以兩種富含賴氨酸的形式存在于A盒和B盒中，是染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白，在調(diào)節(jié)核內(nèi)環(huán)境和基因穩(wěn)定性發(fā)揮作用，維持HMGB1 A盒的氧化還原狀態(tài)，可能會(huì)調(diào)節(jié)例如順鉑等藥物的抗腫瘤活性〔7〕。HMGB1能與核小體轉(zhuǎn)錄因子以多種可逆方式相互作用，從而調(diào)控許多基因轉(zhuǎn)錄(例如：增加組蛋白和DNA作用，造成核小體整體結(jié)構(gòu)改變)〔8〕。在內(nèi)源性損傷過程中，HMGB1作為信號(hào)分子參與自噬，高度乙?；腍MGB1在活性氧介導(dǎo)下以主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞綇氖軗p傷細(xì)胞向胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移。核外HMGB1結(jié)合到細(xì)胞表面受體激活下游信號(hào)通路(例如：NF-κB和PI3K通路)，產(chǎn)生細(xì)胞黏附遷移，刺激增殖，誘導(dǎo)自噬等細(xì)胞學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HMGB1可抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，HMGB1是治療惡性腫瘤的潛在靶點(diǎn)〔9〕。

1.2 HMGB1調(diào)節(jié)的自噬與骨肉瘤 HMGB1有3個(gè)半胱氨酸，分別位于第23、45和106位。HMGB1的氧化促進(jìn)了其定位于細(xì)胞外基質(zhì)及其后的自噬過程。相比于正常組織，活性氧和自噬在癌細(xì)胞中都會(huì)發(fā)生改變〔10〕。Tang等〔11〕研究說明HMGB1向胞質(zhì)轉(zhuǎn)移對(duì)于維持和促進(jìn)自噬是必須的。在HMGB1的3種半胱氨酸突變形式中，對(duì)氧化敏感的是半胱氨酸的第106位(C106)突變，而不是第23位(C23)和第45位(C45)突變。在兩組獨(dú)立試驗(yàn)中，C106突變體與野生型相似，然而C23和C45突變個(gè)體喪失了介導(dǎo)自噬的能力。因?yàn)橥蛔兊腍MGB1不能結(jié)合到Beclin-1(Bcl-2作用卷曲蛋白)，無法終止Beclin-1-Bcl-2(B-cell leukemia/lymphoma 2)相互作用，Bcl-2家族的抗凋亡蛋白控制Beclin-1依賴的細(xì)胞自噬〔12〕。Piro等〔13〕研究結(jié)果也顯示，與正常的骨組織相比，骨肉瘤組織中Bcl-2的活性增加，提示Bcl-2在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用并且可以作為腫瘤活性的診斷指標(biāo)。在敲除HMGB1的骨肉瘤細(xì)胞中HMGB1和Beclin-1相互作用被抑制。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，Beclin-1基因在骨肉瘤中的表達(dá)明顯低于正常骨組織，說明自噬在骨肉瘤中發(fā)揮重要作用。HMGB1在活性氧的觸發(fā)下，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外基質(zhì)中，胞質(zhì)中的HMGB1競爭性結(jié)合Beclin-1，在C23和C45作用下破壞Beclin-1同Bcl-2相互作用，HMGB1通過控制Beclin1-Bcl-2復(fù)合體解離與結(jié)合控制自噬進(jìn)程。Beclin-1同Bcl-2的解離是參與激活自噬和控制凋亡的重要機(jī)制。HMGB1與Beclin-1正相互作用由ULK(ULK)調(diào)節(jié)，負(fù)調(diào)控由P53調(diào)節(jié)〔14〕。另外，上調(diào)的HMGB1與Bcl-2競爭性結(jié)合Beclin-1，促進(jìn)Beclin-1/PI3kc3復(fù)合體形成，促進(jìn)細(xì)胞自噬〔15〕。HMGB1的敲除抑制了在自噬體形成過程中LC3-II的表達(dá)，并且在MG-63細(xì)胞中抑制了LC3顆粒結(jié)構(gòu)的聚集。超微機(jī)構(gòu)分析顯示HMGB1沉默的MG-63細(xì)胞在應(yīng)用抗癌藥物后僅有幾個(gè)自噬體形成。利用P62形成的蛋白聚集會(huì)被自噬降解的特點(diǎn)，用P62測定自噬通量，HMGB1敲除的MG-63細(xì)胞抑制了P62降解，這些均顯示HMGB1調(diào)節(jié)的自噬在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔16〕。

內(nèi)源性HMGB1促進(jìn)自噬進(jìn)而影響藥物治療，3-甲基腺嘌呤(3-MA)是自噬的抑制劑，阻斷自噬體形成并且抑制自噬依賴的蛋白質(zhì)降解，敲除Beclin-1或使用3-MA通過抑制自噬使得骨肉瘤對(duì)藥物更加敏感〔17〕。3-MA和順鉑(DDP)共同處理的MG-63細(xì)胞增殖抑制率明顯高于DDP組，說明骨肉瘤對(duì)藥物敏感性增強(qiáng)可能是通過下調(diào)自噬實(shí)現(xiàn)〔18〕。HMGB1介導(dǎo)的自噬也是骨肉瘤產(chǎn)生抗藥性的主要原因，在體內(nèi)外研究中均發(fā)現(xiàn)HMGB1和自噬抑制都能增加骨肉瘤對(duì)藥物的敏感性。粘著斑激酶家族相互作用蛋白(FIP)200是一種ULK 結(jié)合蛋白，HMGB1和Beclin-1的相互作用需要ULK1-FIP200復(fù)合物的參與，并且促進(jìn)了Beclin-1-PI3KC3復(fù)合物的形成和自噬的進(jìn)展。在野生型骨肉瘤細(xì)胞株中，雷帕霉素預(yù)處理能保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，然而雷帕霉素很少保護(hù)HMGB1敲除的骨肉瘤細(xì)胞。過表達(dá)的HMGB1還能發(fā)揮抗凋亡作用。在HMGB1介導(dǎo)自噬研究中發(fā)現(xiàn)骨肉瘤耐藥性的新機(jī)制，這將為骨肉瘤耐藥性的產(chǎn)生提供了新的治療方法。

2 mTOR調(diào)節(jié)的自噬與骨肉瘤

在自噬的活性調(diào)節(jié)中，mTOR 是調(diào)節(jié)自噬信號(hào)途徑的關(guān)鍵信號(hào)分子，目前國內(nèi)外對(duì)mTOR信號(hào)途徑在骨肉瘤中的研究報(bào)道較少。mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR 信號(hào)通路由于處于生長調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)而倍受關(guān)注。mTOR 作為自噬啟動(dòng)階段信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游調(diào)控因素，調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達(dá)。mTOR 能夠磷酸化ULK1和ULK2，阻止自噬的發(fā)展〔19〕。當(dāng)位于細(xì)胞表面的酪氨酸激酶受體(RTK)和G 蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)與相應(yīng)的細(xì)胞外配體相結(jié)合就可以隔離磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的調(diào)節(jié)亞基并釋放催化亞基，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)磷酸化，轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峒〈既姿?PI3P)。PI3P 是一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，可以與許多具有同源性底物的蛋白質(zhì)相結(jié)合，如磷酸肌醇依賴的激酶1(PDK1)和激活的蛋白激酶B(AKT)，PDK1與PI3P 在細(xì)胞膜上結(jié)合并使AKT磷酸化，激活的AKT可以使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中許多目標(biāo)蛋白磷酸化，抑制mTORC1的激活，促進(jìn)自噬發(fā)生〔20〕。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)途徑抑制過度自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，AKT是PI3K的下游效應(yīng)物，mTOR是AKT的下游效應(yīng)物，mTOR分為mTOR復(fù)合物1(mTOR Complex 1,mTORC1)和mTOR 復(fù)合物2(mTOR Complex 2,mTORC2)。mTORC1包括mTOR、Raptor和gβ1。mTOR和Raptor相互作用調(diào)節(jié)mTOR激酶活性〔21〕。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR抑制劑與自噬抑制劑共同作用能通過抑制細(xì)胞凋亡途徑進(jìn)而有效地治療骨肉瘤〔22〕。PI3K/AKT通路是mTORC1的主要調(diào)節(jié)物，在多種腫瘤細(xì)胞中參與細(xì)胞存活和抑制凋亡。激活的PI3K/AKT 參與人類骨肉瘤Saos-2 細(xì)胞系的凋亡抑制。生長因子通過PI3K活化或者AKT第473位絲氨酸殘基磷酸化〔23〕?；罨腁KT通過抑制Bcl-2第136位色氨酸殘基磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)途徑抑制過度自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，另一方面mTORC1能刺激受損或毒性蛋白自噬，上調(diào)細(xì)胞存活效應(yīng)通過 mTORC2活化AKT〔24〕。此外，研究發(fā)現(xiàn)mTOR抑制物雷帕霉素靶蛋白使P62和微管相關(guān)蛋白1(MAP1)LC3水平明顯升高，P62被認(rèn)為是自噬和蛋白泛素化的標(biāo)志，提示雷帕霉素可激活自噬，誘導(dǎo)MG63細(xì)細(xì)胞凋亡〔25〕。

3 Atg4B調(diào)節(jié)的自噬與骨肉瘤

在骨肉瘤中有兩條主要自噬通路：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路和第三類磷脂酰肌醇激酶(Ptdins3K)通路〔26〕。mTOR通過刺激增強(qiáng)Ptdins3k的活性，抑制ULK1/2(mammalian orthologs of yeast Atg1)復(fù)合體形成。mTOR抑制劑雷帕霉素在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中誘導(dǎo)自噬介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。Ptdins3K 合成三磷酸磷脂酰肌醇，在自噬體形成的過程中給自噬相關(guān)基因(Atg)提供了一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。這兩種途徑通過調(diào)節(jié)Atg4或者Atg7的活性調(diào)控微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B(MAP1LC3B)脂質(zhì)體形成。Atg4B是LC3B的主要激活物，Atg4B對(duì)于催化LC3B羧基端裂解具有最高的催化活性〔27〕。Atg4B和LC3B對(duì)于維持和增強(qiáng)自噬是必不可少的。一旦LC3B羧基端的甘氨酸暴露給Atg4B，Atg7在腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)依賴性激活LC3B并傳遞給Atg3，這使得LC3B結(jié)合到磷脂酰乙醇胺，實(shí)現(xiàn)LC3B的脂化。脂化的LC3B錨定這些自噬蛋白形成自噬體，并通過這種方式促進(jìn)膜膨脹擴(kuò)張自噬體，以此提高自噬強(qiáng)度〔28〕。脂化的LC3B或者在自噬體內(nèi)被降解或者被Atg4B切割，或者重新回收利用。Atg4B激活LC3B的脂化并且回收脂化的LC3B，使其成為游離狀態(tài)。LC3B在脂質(zhì)體形成中必不可少，并且影響到自噬泡大小和沿微管的運(yùn)輸〔29〕。Atg4B提供給細(xì)胞足夠的LC3B擴(kuò)大自噬，并回收LC3B脂質(zhì)體，維持自噬，這可能與骨肉瘤治療過程中抗藥性的產(chǎn)生有關(guān)。在缺乏氨基酸且沉默Atg4B的骨肉瘤細(xì)胞株中，沉默Atg4B的細(xì)胞株比對(duì)照組細(xì)胞更敏感，Atg4B對(duì)于骨肉瘤中的細(xì)胞生長有積極作用。在敲除Atg4B的Saos-2骨肉瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)饑餓誘導(dǎo)的自噬缺陷。在缺乏氨基酸的培養(yǎng)基中，沉默Atg4B的Saos-2細(xì)胞死亡，在小鼠體內(nèi)則表現(xiàn)為減緩腫瘤生長。Akin等〔30〕研究發(fā)現(xiàn)藥物NSC185058抗腫瘤作用與影響Atg4B功能和抑制自噬有關(guān)，高濃度的NSC185058降低了Saos-2的細(xì)胞活力，然而在缺乏Atg4B的骨肉瘤細(xì)胞株不敏感，因此認(rèn)為抑制自噬作用是Atg4B抗腫瘤作用的主要機(jī)制。

4 microRNA(miRNA)調(diào)節(jié)的自噬與骨肉瘤

miRNA是長度在18～25 nt的內(nèi)源性非編碼核苷酸，從線蟲到哺乳動(dòng)物保持高度同源性。miRNA在后期轉(zhuǎn)錄和調(diào)控翻譯等生物學(xué)功能上發(fā)揮作用，miRNA幾乎影響所有的生物進(jìn)程，進(jìn)而影響基因表達(dá)和細(xì)胞生長〔31〕。研究顯示miRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，多種miRNA通過改變自噬參與骨肉瘤發(fā)生與發(fā)展。

4.1 miR-22與骨肉瘤 miR-22既可作為抑癌基因也可作為原癌基因。它在細(xì)胞生長、增殖、遷移、侵襲、衰老中起著十分關(guān)鍵的作用〔32〕。miR-22抑制核轉(zhuǎn)錄因子SPl、Sirtl(silent mating type information regulation 2 homolog 1)和CDK6(CDK6)的抗衰老作用而促進(jìn)癌細(xì)胞衰老，也可抑制細(xì)胞生長、增殖和侵襲〔33〕。有研究顯示在骨肉瘤組織中miR-22表達(dá)量較正常骨組織降低，miR-22表達(dá)水平與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)〔34〕。在轉(zhuǎn)染miR-22的骨肉瘤細(xì)胞中，HMGB1 mRNA和蛋白質(zhì)水平降低。應(yīng)用抗腫瘤藥物后，miR-22表達(dá)增加。過表達(dá)miR-22能夠與HMGB1的3'端非翻譯區(qū)配對(duì)，使得HMGB1表達(dá)下調(diào)，阻斷自噬〔35〕。由此miR-22調(diào)控HMGB1誘導(dǎo)的自噬，并且在骨肉瘤的增殖遷移發(fā)揮重要作用。過表達(dá)miR-22抑制了細(xì)胞增殖和抗腫瘤藥物處理的骨肉瘤細(xì)胞集落的形成，提示miR-22在減少骨肉瘤化療期間抗藥性產(chǎn)生具有異常的潛力。

4.2 miR-101與骨肉瘤 microRNA在許多細(xì)胞進(jìn)程中是主要監(jiān)管者，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和包括自噬在內(nèi)的生物進(jìn)程。自噬的兩個(gè)主要特征是酸性小泡(AVOS)的形成和由LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的高轉(zhuǎn)化率，他們?yōu)長C蛋白的兩種主要形式，對(duì)于自噬體形成發(fā)揮作用〔36〕。有研究顯示在經(jīng)過雷帕霉素處理后的骨肉瘤U-2 OS細(xì)胞株，Atg5含量明顯升高，并且LC3-Ⅱ相比于LC3-Ⅰ含量明顯增加。為了檢測miR-101提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，Chang等〔37〕將miR-101轉(zhuǎn)染U-2 OS 細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)自酸性小泡數(shù)量明顯低于對(duì)照組，并且由LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化被抑制。自噬相關(guān)蛋白Atg5無明顯變化，其他自噬相關(guān)蛋白表達(dá)降低，且噻唑藍(lán)(MTT)還原法檢測細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)miR-101能夠降低U-2 OS細(xì)胞活力。因此，miR-101阻斷了由化療藥物引起的自噬，進(jìn)而提高了骨肉瘤細(xì)胞對(duì)藥物敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，作為一種重要的自噬抑制物，miR-101能在腫瘤細(xì)胞中增強(qiáng)藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的遷移侵襲能力〔38〕。在成骨肉瘤Saos-2細(xì)胞和MG-63細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-101后，miR-101表達(dá)明顯上調(diào)。miR-101過表達(dá)抑制了EZH2的活性進(jìn)而抑制侵襲，并且易位的miR-101明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力〔39〕。林松等〔40〕用miR-101模擬物轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-101不但對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，而且可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3B的表達(dá)，提示，miR-101能通過調(diào)控自噬基因表達(dá)影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。

5 結(jié) 語

HMGB1是自噬調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過影響PI3K/AKT/mTORC1途徑，在抗藥性產(chǎn)生過程中起重要作用。Atg4B抑制自噬發(fā)揮抗腫瘤作用，miRNA通過抑制和阻斷自噬也能減少抗藥性產(chǎn)生和對(duì)藥物敏感性。骨肉瘤的發(fā)病是多種原因共同作用的結(jié)果。目前病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚，治療方法主要集中在抗癌藥物聯(lián)合手術(shù)治療，但治療效果較差。發(fā)病機(jī)制的研究是治療骨肉瘤的基礎(chǔ)。若能夠深入探討自噬與骨肉瘤發(fā)病之間的關(guān)系，闡明自噬在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，將為治療骨肉瘤提供新的思路。若能夠通過調(diào)節(jié)自噬通路減少抗藥性產(chǎn)生，提高腫瘤對(duì)藥物的敏感性，將為骨肉瘤的治療提供新的希望。隨著發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，必定會(huì)為骨肉瘤的治療提供可能，人類在對(duì)抗惡性疾病的信心和技術(shù)是不容低估的，相信在不久的將來，骨肉瘤一定會(huì)為人類所克服。

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〔2016-02-01修回〕

(編輯 曲 莉)

國家自然科學(xué)基金(81401066)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2012HQ021)；山東省教育廳課題(J12LK51，J13LK05)；濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(201301074，201302089)

1 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 2 濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院

陳燕春(1979-)，女，副教授，主要從事神經(jīng)退行性疾病及骨腫瘤方面的研究。

鞠 杰(1994-)，男，本科生，主要從事神經(jīng)退行性疾病及骨腫瘤方面的研究。

R738.1

A

1005-9202(2016)23-6024-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.111