彭國瑞，彭小兵，李旭妮，杜吉革，蔣玉文

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

肉毒中毒癥疫苗的研究現(xiàn)狀

彭國瑞，彭小兵，李旭妮，杜吉革，蔣玉文*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

用于預防肉毒中毒癥的傳統(tǒng)疫苗有滅活菌苗和類毒素疫苗，近年來對于重組亞單位疫苗、重組嵌合體疫苗和DNA疫苗等研究成為熱點，文章著重對這些新型疫苗的發(fā)展現(xiàn)狀進行了綜述，以期為相關研究提供借鑒。

肉毒中毒癥；毒素；新型疫苗

肉毒中毒癥(botulism)是機體經(jīng)消化道或傷口攝入了肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)或其外毒素肉毒毒素(botulinum neurotoxin，BoNT)而引起的一種急性、高度致死性、中毒性疾病。肉毒毒素是目前已知毒物中毒性最強的一種，是肉毒梭菌主要的致病性毒力因子，也是防治肉毒中毒癥的關鍵免疫抗原。依據(jù)抗原性，毒素分為A、B、C、D、E和F型，其中A、B、E、F型均可引起人食物中毒，A、B型毒素引起馬、牛、水貂等動物飼料中毒，C型毒素為馬、牛、羊以及水貂肉毒中毒癥和水禽軟頸病的主要病因，D型毒素是牛、綿羊肉毒中毒的病因。大多數(shù)菌株只產(chǎn)生一種毒素，有些可產(chǎn)生兩種，但其中一種占優(yōu)勢，如Ab、Af、Ba、Be、Bf，用各型毒素或類毒素免疫動物，只能獲得中和相應型毒素的特異性抗毒素。有些產(chǎn)生C/D嵌合毒素，但沒有菌株可以同時產(chǎn)生C和D兩種毒素，C、D毒素有共同的表位，多抗有交叉反應[1]。盡管各型之間在免疫學特性、毒力、自然致病動物類型上各不相同，但生化作用和結構卻極為相似。該毒素通常由相對分子質(zhì)量約150 kD的單鏈毒素前體，經(jīng)內(nèi)源性或外源性蛋白酶作用產(chǎn)生切口，形成以二硫鍵相連的雙鏈結構，其中相對分子質(zhì)量約50 kD較小片段為輕鏈(light chain，LC)，具有鋅依賴金屬內(nèi)肽酶活性，是毒素的毒性作用位點；100 kD較大片段為重鏈(heavy chain，HC)不具毒性，負責與受體結合及輕鏈的內(nèi)化[2]。

肉毒中毒癥對公共衛(wèi)生、安全和畜牧業(yè)存在著較大的風險，接種疫苗是預防該病最有效的方法之一。目前針對該病的常規(guī)疫苗有滅活疫苗和類毒素疫苗，隨著生物技術的發(fā)展，重組亞單位疫苗，重組嵌合體疫苗和DNA疫苗等新型疫苗的研究得到迅速發(fā)展。本文將就這些新型疫苗的研究現(xiàn)狀進行綜述，以期為相關研究提供借鑒。

1 常規(guī)疫苗

滅活菌苗是將含特定毒素型肉毒梭菌菌液用甲醛溶液滅活后，加入適當?shù)淖魟┗蚴歉稍锾幚碇瞥?，多種毒素型按適當比例添加制成多價苗，或是與預防其他疾病的疫苗一同制成聯(lián)苗。與菌苗相比純化后脫毒制備的類毒素疫苗，可以降低雜蛋白可能引起的副反應。美國、德國和俄羅斯研制和儲備了單價、三價和五價的類毒素疫苗，主要用于實驗室工作人員和執(zhí)行特殊任務軍人的免疫接種[3]。澳大利亞和非洲的一些國家，每年都會對水貂、牛、羊、雉等畜禽進行類毒素免疫接種[4]。但傳統(tǒng)疫苗制備過程復雜，生產(chǎn)條件要求較高，生產(chǎn)過程存在安全風險，以及脫毒劑在發(fā)揮脫毒作用的同時對抗原表位有一定的破壞，導致免疫效率低。

優(yōu)化脫毒方法，盡可能保持免疫原性關鍵表位的完好，對提高免疫效果具有重要意義。James E K等對脫毒劑濃度、脫毒時間以及是否加入賴氨酸等條件進行研究，表明0.08%甲醛濃度37 ℃脫毒28 d以上可獲得免疫原性優(yōu)良的類毒素[5]。Jones R G等用碘乙酰胺烷基化的方法使B型毒素的毒力降低7個數(shù)量級乃至幾乎無毒狀態(tài)，具體方法是用1體積1mg/ml的毒素與3體積新鮮制備的烷基化緩沖液(66.67 mmol/L Tris、1.33 mmol/L EDTA、2.67 mol/L NaCl、2.67 mol/L尿素和266.7 mmol/L碘乙酰胺，pH8.0)混合，37 ℃作用3 h，然后進行透析。該方法制備的類毒素刺激機體產(chǎn)生的中和抗體比甲醛脫毒法制備的類毒素高600倍[6]，小鼠免疫49 d之后，每毫升血清能中和107個LD50的毒素，較甲醛類毒素和重組受體結合域亞單位疫苗(rBoNT-Hc)的免疫反應更快更有效[7]。

2 重組毒素疫苗

隨著肉毒毒素的結構、生物活性以及基因突變等方面研究不斷深入，有關肉毒中毒癥重組疫苗研究成為熱點。2.1 受體結合域(Hc片段)疫苗 無毒性的肉毒毒素受體結合域片段(BoNT-Hc)能夠有效保護動物模型抵抗相應型毒素攻擊，同時又能降低安全風險，被認為是很有潛力的候選疫苗[8]。Yari等[9]原核表達制備了rBoNT/A-Hc，經(jīng)過對培養(yǎng)基組成、誘導劑劑量、誘導溫度及時間等表達條件進行優(yōu)化，最高獲得了52.1 mg/L的可溶性rBoNT/A-Hc。Byrne等[10]在真核畢赤酵母表達人工合成編碼BoNT-Hc的基因，純化后每千克濕細胞可產(chǎn)生純度超過98%具有免疫原性的rBoNT-Hc蛋白200～500 mg。以弗氏佐劑或鋁膠佐劑皮下和肌肉注射免疫rBoNT/F-Hc一次(5 mg)或二次免疫(每次≥0.04 mg)就能夠保護小鼠對2×104個LD50的BoNT/F攻擊[11]。Yu YZ等[12]證實小鼠二次免疫(每次≥0.2 mg)或三次免疫(每次≥0.04 mg)的rBoNT/A-Hc后均能抵抗106個LD50毒素的攻擊。由于BoNT-Hc基因中含較高的A和T不利于原核表達，Zichel等[13]用天然基因在含有蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶(PDI)以及具有還原或氧化作用的非細胞開放系統(tǒng)(CE)中，直接制備了A、B和E型肉毒毒素Hc片段的融合蛋白，提高了產(chǎn)量，動物實驗證實其具有很好的免疫原性。2004年第一個肉毒中毒癥重組亞單位疫苗rBV A/B (Pichia pastoris)被用于人體臨床試驗[14]。在重組嵌合疫苗的研究方面，嵌合了LTB佐劑的C和D型肉毒毒素Hc片段免疫牛，產(chǎn)生的抗體可以分別中和5 IU/mL的C型肉毒素和6.14±1.06 IU/mL的 D型肉毒素，這一效果得到了巴西農(nóng)業(yè)部的認可[15-16]。

2.2 突變型重組毒素疫苗 對A型肉毒毒素的基因E224A/E262A位點進行雙基因突變，得到與天然毒素結構相似的無毒性突變型重組毒素，小鼠腹腔注射免疫24.0 μg，用紅外(NIR 800)標記檢測其在體內(nèi)的分布情況類似于天然毒素，通過吸入免疫刺激產(chǎn)生的體液免疫和粘膜免疫水平足以使小鼠抵抗天然毒素攻擊[17]。

2.3 其他候選亞單位疫苗 羅森和賈宏麗等通過原核表達系統(tǒng)獲得了重組A型肉毒毒素輕鏈(rBoNT/A-LC)，研究證實其具有反應活性和蛋白酶催化活性[18-19]。血細胞凝集素33 (HA-33)是BoNT/A復合體的組成成分，在腸道內(nèi)對BoNT/A起保護和輔助作用，Sayadmanesh等[20]研究表明，重組HA-33免疫小鼠兩周后，用ELISA檢測免疫血清，對HA-33的抗體滴度可達1∶128000。但是，能否將這些重組蛋白作為候選亞單位疫苗用于肉毒癥的預防還需進一步的試驗研究。

3 DNA疫苗

Scott等[21]以單價和三價A、B和E型肉毒毒素受體結合域片段(BoNT-Hc)為靶位，人工合成了DNA疫苗，免疫實驗動物后，激活了強大的體液免疫和CD4 T細胞免疫，二次免疫可以實現(xiàn)對機體的完全保護，免疫血清能中和最小致死劑量的毒素。Balb/c小鼠接種了攜帶BoNT/A-Hc基因的來源于森林病毒(SFV)質(zhì)粒DNA復制子的疫苗后，AHc和粒細胞巨噬細胞克隆刺激因子(GM-CSF)在SFV上共表達，特異性地激活了機體針對AHc的體液免疫和細胞免疫，免疫原性被加強，抗AHc抗體滴度和小鼠對BoNT/A攻擊的存活率均顯著提高，再經(jīng)磷酸鋁膠佐劑二次免疫，免疫效力得到進一步增強[22]。這些研究結果證明，DNA疫苗可以誘導機體產(chǎn)生免疫保護。

4 展望

許多國家都將肉毒毒素列為食品安全的重要關注對象，同時作為一種生物武器，其也受到了一些軍事機構和疾病預防控制中心的重視。因此，一直以來疫苗研究都是這一領域的熱點。新型重組亞單位疫苗、突變無毒型疫苗和DNA疫苗可以克服一些傳統(tǒng)疫苗的不足，但在提高疫苗抗原含量，保證免疫效果的穩(wěn)定性，開發(fā)有效的免疫佐劑，研究適合產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)技術等方面還需更進一步的探索。在這些新型疫苗中，重組受體結合域(Hc片段)疫苗較其他類型的疫苗研究較為深入，免疫效果也更為確實，是當前和今后可能被應用于臨床實踐的主要研究方向。隨著生物信息技術的發(fā)展，利用生物信息技術設計疫苗，模擬機體免疫應答是今后疫苗開發(fā)很好的思路。另外，有1/3的天然毒素多肽分子具有通過空氣途徑被吸入，激活免疫反應，而且這些多肽還可以作為載體分子用于其他病原的吸入免疫[23]，利用這一特點，研制使用更為方便，吸入式免疫的肉毒中毒癥疫苗或是其他疾病疫苗對于臨床應用將是十分有意義的。

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(編輯：李文平)

Current Status of Research on Botulism Vaccines

PENG Guo-rui, PENG Xiao-bing, LI Xu-ni, DU Ji-ge, JIANG Yu-wen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

The traditional vaccines included inactivated vaccines and toxoid vaccines, and the new types of vaccines included recombinant subunit vaccines, recombinant chimeric vaccines and DNA vaccines. In order to provide reference for development on botulism vaccines, this paper reviewed the current status of research on these vaccines which had been developed rapidly in recent years.

botulism; neurotoxin; new types of vaccines

彭國瑞，碩士，從事獸用生物制品檢驗和研究工作。

蔣玉文。E-mail：jiangyuwen@ivdc.org.cn

2016-06-03

A

1002-1280 (2016) 09-0066-04

S859.797