葛蘭云

（黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150088）

新型口蹄疫疫苗的研究概況

葛蘭云

（黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150088）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的主要感染偶蹄動(dòng)物的一種人畜共患病。FMD的持續(xù)感染對(duì)流行區(qū)域的畜牧業(yè)造成了毀滅性的影響，因此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織呼吁進(jìn)行全球范圍內(nèi)控制和清除FMDV。安全有效的疫苗是成功預(yù)防、控制乃至最終消滅FMD的先決條件，本文主要介紹口蹄疫重組亞單位疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗、活病毒載體重組疫苗的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用。

口蹄疫 新型疫苗 傳統(tǒng)疫苗

口蹄疫是世界性的動(dòng)物疫病，其病原有7個(gè)血清型且相互之間沒有交叉保護(hù)，這給該病的防治帶來(lái)了極大的困難。若使口蹄疫防控效果具有突破性的進(jìn)展，關(guān)鍵在診斷檢測(cè)技術(shù)和疫苗。隨著生物技術(shù)的發(fā)展、分子免疫學(xué)的研究以及基因工程技術(shù)的應(yīng)用，多種新型疫苗隨之誕生，這為口蹄疫的有效防控帶來(lái)了希望。在“全球口蹄疫防控策略”的指導(dǎo)下，截至2015年5月已有49%的OIE成員被認(rèn)可為無(wú)FMD國(guó)家/地區(qū)。本文僅就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外口蹄疫新型疫苗的研究現(xiàn)狀做一概述。

1 重組亞單位疫苗

FMD亞單位疫苗主要是針對(duì)FMDV VP1片段制備的，由于亞單位疫苗只含有病原體的一部分，大大提高了疫苗的安全性。

1.1 細(xì)菌表達(dá)的重組亞單位疫苗

Bachranch等從FMDV粒子上成功分離出VP1衣殼蛋白并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，用弗氏不完全佐劑制成一種亞單位疫苗，免疫監(jiān)測(cè)結(jié)果表明該亞單位疫苗具有良好的免疫效果，為研制基因工程亞單位疫苗提供了依據(jù)。后人在此基礎(chǔ)上對(duì)FMDV VP1蛋白全長(zhǎng)或者部分片段進(jìn)行了表達(dá)輔以不同佐劑免疫動(dòng)物，取得了一定的效果。邵軍軍等構(gòu)建了Asia1型口蹄疫病毒重組表達(dá)質(zhì)粒（pRE-oIgG），用大腸桿菌細(xì)胞分別表達(dá)靶標(biāo)蛋白R(shí)E-oIgG和FMDV 3D蛋白，免疫豚鼠，結(jié)果RE-oIgG與3D的混合物針對(duì)1000 GPID50強(qiáng)毒攻擊后，所有動(dòng)物沒有出現(xiàn)癥狀完全保護(hù)。

1.2 植物表達(dá)的重組亞單位疫苗

植物表達(dá)的重組亞單位疫苗是指利用農(nóng)桿菌或基因槍等技術(shù)，將免疫原性基因?qū)胫参?，獲得的能表達(dá)免疫原基因的植株。Carrillo等把FMDV的主要保護(hù)性抗原基因vpl轉(zhuǎn)入到擬南芥中，用一個(gè)免疫劑量?jī)H為25～50mg葉浸提取物免疫小鼠，而且，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，所有免疫的小鼠均能抵抗FMDV強(qiáng)毒半數(shù)致死量的攻擊。Wigdorovitta等將FMDV VP1的主要表位編碼基因轉(zhuǎn)入煙草中，將提取物免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)小鼠免受同型病毒攻擊的高水平的抗體。Santos等利用苜蓿作為受體材料，成功獲得了共表達(dá)FMDV P1基因和3C基因的轉(zhuǎn)基因苜蓿，免疫小鼠后能100%抵抗致死劑量強(qiáng)毒的攻擊。Pan等［7］在西紅柿中實(shí)現(xiàn)了FMDV P1-2A 基因和3C基因的融合表達(dá)，其提取物可對(duì)豚鼠的攻毒產(chǎn)生完全保護(hù)。但用FMDV轉(zhuǎn)基因植物疫苗進(jìn)行本動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)，免疫效果卻不太理想，所以FMDV轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗的成功使用還有待進(jìn)一步的研究。

1.3 昆蟲表達(dá)的重組亞單位疫苗

由于昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系能夠?qū)⒛康牡鞍自诤线m的細(xì)胞區(qū)室內(nèi)表達(dá)和正確修飾，因此，許多學(xué)者將其應(yīng)用于FMDV 重組蛋白的表達(dá)及疫苗的研制中。Viswanathans等用 FMDV 的 vp1基因在 E.coli 中的表達(dá)產(chǎn)物與重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物分別免疫動(dòng)物，而后用強(qiáng)毒攻擊，結(jié)果證明昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)可誘發(fā)中和抗體，免疫效果優(yōu)于E.coli 中的表達(dá)產(chǎn)物。在國(guó)內(nèi)，冷青文等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了包含有FMDV P12X3C3D多基因片段的重組桿狀病毒，將該病毒感染昆蟲細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)重組桿狀病毒能夠表達(dá)FMDV目的蛋白并且表達(dá)產(chǎn)物能被口蹄疫陽(yáng)性血清識(shí)別。

2 多肽疫苗

FMD多肽疫苗的研究較早，目前豬的FMD疫苗已經(jīng)投入使用。FMD多肽疫苗的研究多集中于VP1的第141-160aa和200-213aa這兩個(gè)肽段。Bittle等根據(jù)FMDV O1型VPl氨基酸序列，化學(xué)合成了140-160段氨基酸多肽與載體蛋白偶聯(lián)，證明了該肽段能引起豚鼠產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體。Dimarch等提出了VP1羧基端氨基酸在提高保護(hù)應(yīng)答中的重要性。楊志軍等［11］用化學(xué)方法合成了O型口蹄疫病毒外殼蛋白VP1中21～40位肽段的T細(xì)胞表位基因與141～160肽段的B細(xì)胞表位基因串聯(lián)后與β-半乳糖苷酶基因相連，并在大腸桿菌中表達(dá)出融合蛋白，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該融合蛋白不僅能誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生高滴度的中和抗體而且能產(chǎn)生大量對(duì)病毒專一性的T細(xì)胞并能抵抗病毒攻擊。朱圖壽等用FMD O型合成肽疫苗免疫的75632頭生豬，其應(yīng)激反應(yīng)率和應(yīng)激反應(yīng)死亡率都比使用滅活類疫苗有明顯降低，免疫抗體合格率則有較大提高。

FMD多肽疫苗的免疫原性均基于它們能遞呈VP1蛋白G-H環(huán)上關(guān)鍵的抗原表位。然而，由于抗原表位多肽分子量小，容易被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶所降解，并且抗原位點(diǎn)并不是病毒粒子上唯一的中和性位點(diǎn)，也不一定能被所有的宿主動(dòng)物識(shí)別。這就導(dǎo)致了多肽疫苗免疫原性較弱，大規(guī)模使用時(shí)，效果并不理想。Rodriguez等［合成了O型口蹄疫病毒VP1蛋白的G-H環(huán)多肽，將其與輔助性T細(xì)胞抗原決定簇的多肽聯(lián)合免疫牛，發(fā)現(xiàn)這些多肽免疫牛后雖然能產(chǎn)生抗體反應(yīng)，但是不能保護(hù)牛抵抗口蹄疫病毒的攻擊，在另外以豬為動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中，卻發(fā)現(xiàn)該多肽能使95%的豬免受口蹄疫病毒的攻擊?？傊?，多肽疫苗在免疫保護(hù)力方面還存在很多問題需要在進(jìn)一步的研究中進(jìn)行解決。

3 核酸疫苗

核酸疫苗也稱DNA疫苗，是指那些注入動(dòng)物體內(nèi)后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)質(zhì)粒。趙凱等以O(shè)型口蹄疫病毒VP1免疫活性肽基因串聯(lián)片段取代豬IgGH鏈可變區(qū)的CDR3區(qū)，并與真核表達(dá)載體pCDM8相連構(gòu)建表達(dá)載體pCDMFH，用表達(dá)載體pCDM-FH對(duì)豚鼠及豬進(jìn)行肌肉注射，免疫效果檢測(cè)及攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，該DNA疫苗可激發(fā)明顯的免疫應(yīng)答及保護(hù)效果。Ma等構(gòu)建了FMDV P1-2A、豬IL-18和FMDV 3C共表達(dá)的核酸疫苗pVIR-P12AIL18-3C和不攜帶豬IL-18的核酸疫苗pVIR-P12A-3C，研究結(jié)果表明，兩個(gè)核酸苗均對(duì)同源FMDV對(duì)豬的攻毒具有很好的保護(hù)性，并且攜帶有豬IL-18基因的核酸疫苗免疫效果優(yōu)于不攜帶豬IL-18的核酸疫苗，說(shuō)明IL-18基因?qū)12A-3C的免疫效果具有增強(qiáng)作用。牟偉峰等構(gòu)建了含有Asia1型FMDV衣殼蛋白前體P1-2A基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXⅠ-P1-2A，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒試驗(yàn)組能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

4 活病毒載體重組疫苗

隨著病毒分子生物學(xué)的深入發(fā)展和遺傳工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，病毒成為了真核基因調(diào)控的良好載體。目前已用于FMD研究的載體主要有痘病毒、腺病毒和偽狂犬病毒載體等。

4.1 FMDV腺病毒活載體疫苗

歷史上人腺病毒疫苗的安全使用為其他腺病毒做為載體的研制奠定了基礎(chǔ)。Sanz Parra A 等構(gòu)建了表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白P1基因的重組腺病毒活載體疫苗Ad5-P1，用Ad5wt和重組的Ad5-P1經(jīng)皮下或鼻內(nèi)接種牛，2次免疫后鼻內(nèi)滴注口蹄疫病毒進(jìn)行攻毒，經(jīng)重組病毒皮下接種兩次的所有動(dòng)物均得到有效的保護(hù)。Mayr等構(gòu)建了可以表達(dá)FMDV衣殼蛋白P1-2A和3C蛋白酶基因的非復(fù)制型人5型腺病毒載體，豬肌肉接種后能夠產(chǎn)生中和抗體，并可完全或部分保護(hù)與人工接種強(qiáng)毒的動(dòng)物相接觸的豬免受病毒的感染。Du等構(gòu)建了VP1基因和VP1主要抗原表位分別與巨噬細(xì)胞集落刺激因子共表達(dá)的重組活載體疫苗rAd-GMCSF-VPe和rAd-GMCSF-VP1，研究結(jié)果表明，兩種疫苗均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的FMDV特異性T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、IFN-γ和IL-4，而且均能對(duì)豬和豚鼠產(chǎn)生攻毒保護(hù)。

4.2 FMDV痘病毒活載體疫苗

痘病毒是研究最早和最成功的病毒載體之一。痘病毒宿主范圍廣、增殖滴度高、穩(wěn)定性好、基因組容量大，有利于進(jìn)行基因工程操作并適合插入多個(gè)外源基因，最重要的事痘病毒抗原性穩(wěn)定、能同時(shí)誘發(fā)體液和細(xì)胞免疫，相對(duì)安全。Berinstein等用結(jié)構(gòu)蛋白前體基因構(gòu)建的重組痘苗病毒免疫牛和小鼠后，用ELISA檢測(cè)動(dòng)物血清發(fā)現(xiàn)，中和抗體效價(jià)高，抗病毒保護(hù)效果好，動(dòng)物可獲得更長(zhǎng)時(shí)間的免疫力。金明蘭等用蹄疫病毒（FMDV）的衣殼蛋白前體P1-2A和蛋白酶3C基因插入到雞痘病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建重組口蹄疫雞痘病毒免疫小鼠后檢測(cè)到了口蹄疫特異性抗體。

4.3 FMDV偽狂犬病毒活載體疫苗

Qi等用偽狂犬病毒載體共表達(dá)FMDV的P1-2A和豬細(xì)小病毒VP2蛋白，將重組病毒免疫小鼠后結(jié)果表明，該病毒能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的抗FMDV的中和抗體并且能夠保護(hù)小鼠免受口蹄疫病毒的攻擊。Yao等用偽狂犬病毒為載體構(gòu)建了共表達(dá)FMDV 的P12A3C基因的重組活載體疫苗，將其與用P12A3C構(gòu)建的DNA疫苗進(jìn)行了免疫效果比較，結(jié)果，F(xiàn)MDV偽狂犬病毒重組活載體疫苗能誘導(dǎo)較高的抗體水平，可對(duì)豚鼠的攻毒產(chǎn)生完全保護(hù)，而DNA疫苗抗體水平較低，只能對(duì)豚鼠的攻毒部分保護(hù)。偽狂犬病毒載體在疫苗研制、基因表達(dá)和基因投遞等方面都顯示了很好的優(yōu)越性。

目前，口蹄疫新型疫苗的研究和應(yīng)用取得了一定的進(jìn)展但仍處于初級(jí)階段。因此，新型疫苗要取代傳統(tǒng)疫苗成為防治乃至消滅口蹄疫的中堅(jiān)力量還有待于各項(xiàng)科研技術(shù)的進(jìn)一步完美結(jié)合。

葛蘭云（1982-），女，碩士研究生，講師。