許文景　黃冬云　陳　平　徐興祥

(中南大學湘雅二醫(yī)院呼吸內科，長沙410011)

microRNA-Let-7a在肺癌患者中的表達及其抑癌機制的探討①

許文景黃冬云陳平徐興祥①

(中南大學湘雅二醫(yī)院呼吸內科，長沙410011)

[摘要]目的：探討非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)患者血清和肺癌組織中microRNA-Let-7a表達水平以及對肺癌細胞侵襲和增殖影響。 方法：選取我院50例NSCLC患者為研究組，50例同期體檢健康者為對照組，采用Real-time RCR檢測肺癌患者腫瘤組織和血清中microRNA-Let-7a表達水平；對肺癌細胞株A549轉染microRNA let-7a mimics后，transwell法觀察microRNA-Let-7a對肺癌細胞侵襲的影響，CCK-8法檢測肺癌細胞增殖的變化； Real-time RCR及Western blot檢測了A549中k-Ras mRNA及蛋白水平。 結果：microRNA-Let-7a在肺癌患者血清中的表達水平顯著低于正常健康人群，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在腫瘤組織中的表達顯著低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；轉染microRNA let-7a mimics后，A549的侵襲和增殖能力顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，A549中k-Ras mRNA及蛋白表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； 結論：microRNA let-7a在肺癌患者腫瘤組織和血清中低表達，并可減弱肺癌細胞的侵襲和增殖能力，且可能通過Ras信號途徑發(fā)揮作用。

[關鍵詞]microRNA-Let-7a；NSCLC；增殖；侵襲；k-Ras

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是目前世界范圍內致死率最高的腫瘤，預后較差[1]。其中80%是非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]，研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者的5年生存率僅為15%，并且復發(fā)率很高[3]。目前肺癌的治療仍以手術切除為主，輔以放療和化療。肺癌的發(fā)生發(fā)展及轉歸是個極其復雜、多基因參與的過程，但發(fā)病機制尚未完全明確，越來越多的學者關注肺癌細胞內基因表達對肺癌的影響。microRNA是真核生物中小分子非編碼單鏈RNA，長約22~24個核苷酸，通過和miRNA3′-UTR 非翻譯區(qū)的堿基配對來調控mRNA的翻譯與降解[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)多種microRNA在腫瘤的發(fā)病機制中表現(xiàn)為促癌或者抑癌作用。microRNA-Let-7a是最早發(fā)現(xiàn)的microRNA之一，已證實microRNA-Let-7a參與細胞分化、增殖和凋亡、個體發(fā)育、機體代謝以及病毒感染等過程[6]，并且在卵巢癌[7]、乳腺癌[8]等多種腫瘤細胞中表達顯著下調。microRNA-Let-7a對肺癌細胞影響的報道尚少，本文旨在研究microRNA-Let-7a在肺癌患者組織和血清中的表達，對肺癌細胞侵襲及增殖能力的影響，從而對于肺癌的防治提供一定的理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料研究組： 選取2013年9月~2015年6月期間，本科室肺癌手術患者50例為研究組，男38例，女12例，年齡29～75歲，平均年齡(46.7±8.7)歲。所有患者術前均未經介入或放化療等治療，均接受了肺癌根治性切除術，所有患者術后病理學證實為非小細胞肺癌，且未發(fā)現(xiàn)遠處轉移，排除合并其他慢性病如高血壓、糖尿病或其他腫瘤等的患者。

對照組： 為同期健康體檢人群50例，其中男32例，女18例，年齡31～73歲，平均年齡(51.8±6.1)歲。留取肺癌患者和正常健康組外周血2 ml，靜置6 h后，離心取上清；于腫瘤組織術中離體30 min內留取肺癌組織及對應癌旁組織，待測。

1.1.2主要試劑肺癌細胞株A549購自ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；microRNA let-7a mimics、穩(wěn)定陰性對照let-7a -NC和引物U6、GAPDH、K-ras購自上海吉瑪生物技術有限公司；RNA提取試劑盒Trizol購于Gibco公司；Real-time PCR試劑盒購自ROCHE公司；抗K-ras抗體購自Abcam公司；抗β-actin抗體購自SantaCruz公司；羊抗兔二抗購自SantaCruz公司；CCK-8購自上海博谷生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)A549細胞在含10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至對數生長期，以1×105個細胞/平皿接種于25 ml培養(yǎng)瓶平皿，置于37℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱，孵育細胞。

1.2.2細胞轉染采用脂質體2000(美國Invitrogen公司)對人肺癌細胞株A549中microRNA let-7a的轉染，并以PBS、let-7a -NC作為對照，于48 h后檢測其干擾效率。

1.2.3檢測指標

Real-time PCR檢測microRNA let-7a表達水平：將留取的肺癌患者及對照血清、腫瘤組織和轉染后A549，依照產品說明書，以U6作為內參，Real-time PCR檢測microRNA let-7a的表達水平。

Real-time PCR檢測轉染后A549中k-Ras mRNA表達水平：將培養(yǎng)至對數生長期的肺癌細胞，用Trizol提取各組總RNA，反轉錄為cDNA，以GAPDH作為內參，依照產品說明書，測定k-Ras mRNA的變化。k-Ras引物正向：5′-TTGATTTGTCAGCAGGACCA-3′；反向：5′-GAGAGTTTCACAGCATGGACTG-3′。PCR使用ABI公司的7900型號Real-Time PCR儀器，結果采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

Western blot檢測轉染后A549中k-Ras蛋白表達水平：轉染后肺癌細胞培養(yǎng)至對數生長期，按照蛋白抽提步驟，提取總蛋白；采用BCA法測定總蛋白濃度，經SDS-PAGE 電泳后轉移到NC膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，TBST 洗滌后，分別加入1∶1 000抗k-Ras抗體、1∶500抗β-actin抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加入1∶5 000辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h ，再用TBST 洗滌，化學發(fā)光并曝光成像。Weastern blot檢測以β-actin條帶作為內參，k-Ras條帶與其比較，觀察k-Ras蛋白表達變化。

細胞遷移實驗：將處于對數生長期的轉染后肺癌細胞，調整細胞密度至4×105個/ml，按0.1 ml/孔加入到24孔板懸掛式transwell(millipore公司)小室的上層，小室下層加入1 ml的含有10%血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，對己遷移至小室下層的細胞進行計數(隨機選取5個視野)。

細胞增殖實驗：將對數生長期的細胞以50%的匯合率接種至96孔板，每組設置3個復孔，同時設置不含細胞的空白培養(yǎng)基作為對照，37℃，5%CO2，95%濕度下培養(yǎng)24 h后，分別在培養(yǎng)孔加入10 μl CCK-8溶液；孵育2 h，美國biotek(Elx800)酶標儀檢測450nm的吸光值，每孔實測OD值需減去空白對照OD值，取三復孔平均值，記錄OD值。

2結果

2.1肺癌患者血清中microRNA let-7a的表達水平microRNA let-7a在肺癌患者血清中表達顯著低于正常健康人群(表1)，具有統(tǒng)計學意義(t=17.678，P<0.001)，提示了肺癌患者血清中microRNA let-7a的低表達水平，可能與肺癌的發(fā)病密切相關。

表1肺癌患者血清中microRNA let-7a的表達水平

Tab.1Expression level of let-7a microRNA in serum of patients with lung cancer

Note：Compared with normal group,1)t=17.678，P<0.001

2.2肺癌患者組織中microRNA let-7a的mRNA表達水平microRNA let-7a在肺癌患者腫瘤組織中 表達顯著低于對應的癌旁組織(表2)，具有統(tǒng)計學意義(t=22.845，P<0.001)，提示了肺癌患者腫瘤組織中microRNA let-7a的低水平表達，可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展和預后轉歸密切相關。

表2肺癌患者組織中microRNA let-7a的表達水平

Tab.2Expression level of let-7a microRNA in tissue of patients with lung cancer

Note：Comparison with adjacent tissues,1)t=22.845，P<0.001

2.3肺癌細胞轉染后microRNA let-7a mRNA表達水平變化肺癌細胞株A549轉染microRNA let-7a mimics后，同對照相比，microRNA let-7a mRNA的表達水平顯著升高(圖1)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，提示高表達microRNA let-7a肺癌細胞構建成功。

2.4肺癌細胞中microRNA let-7a對細胞增殖的影響肺癌細胞A549轉染microRNA let-7a mimics后，同對照相比，肺癌細胞增殖顯著減少(圖2)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，提示了microRNA let-7a具有增強肺癌細胞增殖的能力。

2.5肺癌細胞中microRNA let-7a對細胞侵襲功能的影響肺癌細胞A549轉染microRNA let-7a mimics后，同對照相比，transwell小室下層細胞數量顯著減少(圖3)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，提示了microRNA let-7a具有增強肺癌細胞侵襲的能力。

2.6肺癌細胞A549轉染microRNA let-7a mimics后k-Ras mRNA和蛋白表達影響為了探討microRNA let-7a對于肺癌細胞A549侵襲能力的影響機制，我們檢測轉染microRNA let-7a mimics基因后肺癌細胞的k-Ras mRNA和蛋白表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，k-Ras mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(圖4)，提示microRNA let-7a可能是通過促進肺癌細胞k-Ras的表達影響癌細胞的侵襲能力。

3討論

肺癌是目前為止世界范圍內發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。全世界每年新發(fā)肺癌病例數為180多萬，占所有惡性腫瘤新發(fā)病例的13%，每年肺癌導致的死亡患者約160萬，占所有惡性腫瘤死亡人數的19.4%[9]。在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率一直居于所有腫瘤的首位，據統(tǒng)計，2010年我國肺癌發(fā)病率占所有惡性腫瘤的19.59%，死亡率占所有惡性腫瘤的24.89%[10]，而且多數肺癌患者就診時已經是晚期。因此，特異性的基因調控靶點對于肺癌的診斷和治療至關重要。

microRNA作為一種在轉錄水平調節(jié)基因表達的約22~24個核苷酸大小的小分子RNA，廣泛的存在于組織、血漿或血清以及其他體液中，且在體內表達比較穩(wěn)定。microRNA let-7家族是最早發(fā)現(xiàn)的microRNA 之一，具有組織特異性、高度保守性和時序性[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，microRNA let-7a的表達與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關，在腫瘤中起到“抑癌基因”的作用，可作為腫瘤診斷和判斷預后的檢測指標[12]。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中microRNA let-7a的表達顯著低于同期健康人群；此外，肺癌患者腫瘤組織中的microRNA let-7a的表達顯著低于相對應的癌旁組織，結果均提示microRNA let-7a在肺癌患者血清和腫瘤組織中的表達水平的變化可能是調控肺癌細胞中的信號途徑，參與肺癌的發(fā)生發(fā)展和轉歸。Sakurai等[13]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者體內microRNA let-7a表達水平下降，且LIN28通過抑制microRNA let-7a的成熟，參與乳腺癌的發(fā)病，這些結果從側面支持了本研究。

腫瘤細胞的侵襲和增殖能力與腫瘤的轉移和生長速度密切相關，影響著腫瘤的發(fā)展和轉歸[14,15]。本研究通過細胞轉染技術，在A549細胞株內高表達microRNA let-7a，同低表達microRNA let-7a的A549細胞株相比，通過transwell實驗發(fā)現(xiàn)高表達microRNA let-7a的肺癌細胞的侵襲能力顯著弱于低表達microRNA let-7a的肺癌細胞，說明microRNA let-7a表達水平的高低影響著肺癌細胞的侵襲能力。此外，本研究運用CCK-8實驗研究肺癌細胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)高表達microRNA let-7a肺癌細胞的增殖能力顯著弱于低表達microRNA let-7a的肺癌細胞，說明microRNA let-7a表達水平越高，肺癌細胞的增殖能力越弱。microRNA let-7a的表達水平影響肺癌細胞的侵襲和增殖能力。這與Wang等[16]在結腸直腸癌中的研究結果是一致的。

Ras癌基因在人類腫瘤中常發(fā)生突變激活，尤其是在胰腺癌、結腸癌和肺癌等腫瘤中[17]。在肺癌的Ras基因家族點突變中90%為k-Ras基因突變，約25%的非小細胞肺腺癌中發(fā)現(xiàn)k-Ras基因突變。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，高表達microRNA let-7a的A549中，k-Ras mRNA及蛋白表達水平顯著降低，提示microRNA let-7a可能通過影響k-Ras的表達，從而影響肺癌細胞的侵襲和增殖能力。這與Wang等[18]的研究結果是一致的。

綜上所述，在肺癌患者血清和腫瘤組織中microRNA let-7a的表達水平顯著降低，而且高表達microRNA let-7a可能減弱肺癌細胞的侵襲和增殖能力，從而使肺癌生長速度減慢，侵襲能力下降，這為肺癌診斷和治療的新靶點提供了理論參考依據。

參考文獻：

[1] Meng J,Xie W,Cao L,etal.shRNA targeting HDGF suppressed cell growth and invasion of squamous cell lung cancer[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2010,42(1):52-57.

[2] Jemal A,Siegel R,Ward E,etal.Cancer statistics,2009[J].CA Cancer J Clin,2009,59(4):225-249.

[3] Miller YE.Pathogenesis of lung cancer:100 year report[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2005,33(3):216-223.

[4] Vrba L,Jensen TJ,Garbe JC,etal.Role for DNA methylation in the regulation of miR-200c and miR-141 expression in normal and cancer cells[J].PLoS ONE,2010,5(1):e8697.

[5] Iorio MV,Croce CM.MicroRNA dysregulation in cancer:diagnostics,monitoring and therapeutics.A comprehensive review[J].EMBO Mol Med,2012,4(3):143-159.

[6] Toledano H.The role of the heterochronic microRNA let-7 in the progression of aging[J].Exp Gerontol,2013,48(7):667-670.

[7] Lu L,Katsaros D,Risch HA,etal.MicroRNA let-7a modifies the effect of Self-renewal gene HIWI on patient survival of epithelial ovarian cancer[J].Mole Carcinogenesis,2015.doi.org/10.1002/MC.22295.

[8] Liu K,Zhang C,Li T,etal.Let-7a inhibits growth and migration of breast cancer cells by targeting HMGA1[J].Int J Oncol,2015,46(6):2526-2534.

[9]Genestreti G,Di Battista M,Cavallo G,etal.Maintenance therapy in non-small cell lung cancer[J].Expert Rev Anticancer Ther,2015,15(7):839-846.

[10]Chen W,Zheng R,Zhang S,etal.Annual report on status of cancer in China,2010[J].Chin J Cancer Res,2014,26(1):48-58.

[11]Ganguly E,Bock ME,Cattini PA.Expression of placental members of the human growth hormone gene family is increased in response to sequential inhibition of DNA methylation and histone deacetylation[J].Biores Open Access,2015,4(1):446-456.

[12]Hu X,Guo J,Zheng L,etal.The heterochronic microRNA let-7 inhibits cell motility by regulating the genes in the actin cytoskeleton pathway in breast cancer[J].Mol Cancer Res,2013,11(3):240-250.

[13]Sakurai M,Miki Y,Masuda M,etal.LIN28:a regulator of tumor-suppressing activity of let-7 microRNA in human breast cancer[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2012,131(3-5):101-106.

[14]Samarzija I,Beard P.Hedgehog pathway regulators influence cervical cancer cell proliferation,survival and migration[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,425(1):64-69.

[15]Zhao QM,Kuang F,Wu H,etal.Attenuation of enoyl coenzyme A hydratase 1 expression in colorectal cancer cells using small interfering RNA inhibits cell proliferation and migration[J].Mol Med Rep,2015,12(1):470-474.

[16]Wang F,Zhang P,Ma Y,etal.NIRF is frequently upregulated in colorectal cancer and its oncogenicity can be suppressed by let-7a microRNA[J].Cancer Lett,2012,314(2):223-231.

[17]Minamoto T,Mai M,Ronai Z.K-ras mutation:early detection in molecular diagnosis and risk assessment of colorectal,pancreas,and lung cancers--a review[J].Cancer Detect Pre,2000,24(1):1-12.

[18]Wang YY,Ren T,Cai YY,etal.MicroRNA let-7a inhibits the proliferation and invasion of nonsmall cell lung cancer cell line 95D by regulating K-Ras and HMGA2 gene expression[J].Cancer Biother Radiopharm,2013,28(2):131-137.

[收稿2015-07-25修回2015-08-17]

(編輯倪鵬)

Expression of microRNA-Let-7a in patients of Non-small cell lung cancer and anti-tumor mechanism

XUWen-Jing，HUANGDong-Yun，CHENPing，XUXing-Xiang.DepartmentofRespiratoryMedicine,XiangyaNo.2HospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410011,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of microRNA-Let-7a in the serum and tumor tissue of non-small cell lung cancer(NSCLC) patients and the effects of cancer cell migration and proliferation.Methods: 50 cases of NSCLC patients in our hospital as the study group,50 healthy volunteers were used as control group,we used Real-time RCR to detect the expression of microRNA-Let-7a in the serum and tumor tissue of NSCLC patients.Using microRNA let-7a mimics transfected into A549,the level of cancer cell migration was observed by transwell,the level of cell proliferation was observed by CCK-8,the level of k-Ras was observed by Real-time RCR and Western blot.Results: The expression of microRNA-Let-7a in the serum and tumor tissue of NSCLC patients was significantly higher than the control group,the difference was statistically significant (P<0.05).After microRNA let-7a transfected into A549,the levels of cancer cell migration and proliferation were significantly decreased,the difference was statistically significant(P<0.05),the mRNA and protein levels of k-Ras were reduced inA549 cells,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion: The expression of microRNA let-7a is low in the serum and tumor tissue of NSCLC patients,and may weaken the levels of cancer cell migration and proliferation through the Ras signaling pathway.

[Key words]microRNA-Let-7a;NSCLC;Migration;Proliferation;k-Ras

作者簡介：許文景(1976年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事肺癌與惡性胸腔積液方面的研究。

中圖分類號R734.2
①蘇北人民醫(yī)院呼吸內科，揚州225001。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0234-05