劉立亞，王慧曄，黃秀蘭

(中央民族大學1.中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學國家民委-教育部重點實驗室、2.生命與環(huán)境科學學院，北京　100081)

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基于細胞自噬的葒草苷抗心肌缺血/再灌注損傷的機制研究

劉立亞1,2，王慧曄1，黃秀蘭1

(中央民族大學1.中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學國家民委-教育部重點實驗室、2.生命與環(huán)境科學學院，北京100081)

摘要：目的本研究主要探討葒草苷抗心肌缺血/再灌注損傷的保護作用與細胞凋亡和細胞自噬的關系。方法采用Langendorff法，建立大鼠離體心臟缺血/再灌注模型，缺血30 min，再灌注120 min；隨機將Wistar大鼠分為正常對照組、模型組、不同劑量葒草苷組(1.0、2.0、4.0 mg·kg-1)、自噬抑制劑組(2.0 mg·kg-1葒草苷+渥曼青霉素)以及陽性對照藥白藜蘆醇組；采用多道生理記錄儀采集血流動力學指標，全自動生化儀檢測灌流液中心肌酶活性，電鏡觀察大鼠心肌細胞超微結構改變及自噬體，TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，Western blot法檢測心肌細胞中自噬相關蛋白LC3和Beclin 1水平。結果與模型組比較，葒草苷可明顯改善大鼠血流動力學指標，降低乳酸脫氫酶和肌酸激酶水平，明顯改善大鼠心肌細胞超微結構變化，同時能降低心肌細胞凋亡水平，增加細胞內(nèi)自噬體數(shù)量以及自噬相關蛋白LC3Ⅱ和Beclin 1表達水平。結論葒草苷對大鼠心臟缺血/再灌注損傷具有明顯保護作用，其機制可能與降低心肌細胞凋亡及增強細胞自噬有關。

關鍵詞：葒草苷；心肌缺血/再灌注損傷；自噬；凋亡；LC3；Beclin 1

心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是指缺血心肌重新獲得新鮮血液供給之后，心肌組織損傷反而進一步加重，甚至轉為不可逆性損傷的現(xiàn)象[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌I/R損傷發(fā)生機制復雜，涉及活性氧損傷、鈣超載心肌細胞能量代謝障礙、線粒體損傷、細胞凋亡以及細胞自噬等多種機制[3-4]。其中細胞凋亡和細胞自噬及其相互作用在心肌I/R損傷發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮非常關鍵的作用[5-6]，是目前研究的熱點。

苗藥都木油(Ndutmongxyoux)為陵齒蕨科烏蕨屬植物烏蕨[Stenolomachusana(L.)Ching]的全草，收載于《廣西中藥志》、《滇南本草》、《中華本草-苗藥卷》等，其單方和復方均具有清熱、解毒、利濕、止血等功效[7]?，F(xiàn)代藥學研究發(fā)現(xiàn)，都木油中含有多種黃酮類化合物如葒草苷、芹菜素等，其中葒草苷因具有良好的抗氧化、抗細胞凋亡等藥理作用[8-9]，而被認為是苗藥都木油作用于心血管系統(tǒng)的主要活性成分之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，葒草苷具有很好的抗心肌I/R損傷和抗心肌細胞缺氧/復氧損傷的作用[10-11]，但其給藥方式多為治療式給藥，即在缺血和或再灌期給藥[10]，而且其抗心肌I/R損傷的作用機制主要集中在抗細胞凋亡上[8,10-11]，而采用預給藥方式的葒草苷抗心肌I/R損傷的作用機制是否與細胞自噬相關，還未見報道。本研究采用Langendorff法建立大鼠離體心臟缺血/再灌注模型，研究葒草苷對細胞自噬與細胞凋亡的調(diào)控作用，為葒草苷及苗藥都木油防治I/R損傷提供藥理學依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠，♂，(240±20) g，SPF 級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2主要試劑和儀器葒草苷(純度>98%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)，白藜蘆醇(純度> 99%，由長沙康隆生物制品有限公司贈送)，渥曼青霉素(Wortmannin，美國Sigma公司)，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒和肌酸激酶(CK-MB)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)，肝素(美國Sigma公司)，戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)，DeadEedTMFluorometric TUNEL檢測試劑盒(美國Promega公司)。16道生理記錄儀(ML880/P PowerLab16/30，澳大利亞AD Instruments公司)；全自動生化儀(7020，日本日立公司)；熒光顯微鏡(IX81，日本Olympus公司)；電鏡(TecnaiSpiri，美國FEI公司)；半干轉印儀(美國Bio-rad公司)。LC3抗體和Beclin 1抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.3復制大鼠離體心臟I/R損傷模型采用Langendorff心臟灌注模型法建立大鼠離體心臟I/R損傷模型：腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)麻醉動物，并腹腔注射肝素液抗凝(250 U·kg-1)，開胸后快速取出心臟置Langendorff灌流架上進行逆行灌流。灌注液用95% O2和5% CO2飽和的K-H液(mmol·L-1：NaCl，118；KCI，4.7；KH2PO4，1.18；EDTA-Na2，0.5；NaHCO3，25；CaCl2，1.7；MgSO4· 7H2O，1.25；Glucose，11.1；pH，7.4±0.5)，灌注壓為75 cm H2O，灌注溫度為37℃。待恒壓灌流平衡30 min心臟參數(shù)穩(wěn)定后，給予全心缺血30 min，再灌注120 min。離體心臟平衡灌注30 min后，心率低于200 BPM，發(fā)展壓LVDP低于931 Pa，或出現(xiàn)心律不齊者舍棄不用。

1.4動物分組及給藥根據(jù)體重將大鼠隨機分為7組(n=6)：正常對照組(Control組)、心肌I/R模型組(I/R組)、不同劑量葒草苷組(1、2、4 mg·kg-1；Ori-1組，Ori-2組，Ori-4組)、自噬抑制劑組(OW組)以及陽性對照藥組白藜蘆醇組(1.5 mg·kg-1，Res組)。各組大鼠給予相應藥物，每天腹腔注射給藥1次，連續(xù)7 d，正常對照組及模型組給予等量生理鹽水。自噬抑制劑組連續(xù)7 d腹腔注射2 mg·kg-1葒草苷后，于分離心臟前30 min腹腔注射0.015 mg·kg-1自噬抑制劑渥曼青霉素。各組通過Langendorff法制備離體心臟I/R損傷模型，缺血30 min，再灌注120 min，正常對照組不進行缺血處理。

1.5血流動力學指標和心肌酶檢測采用16道生理記錄儀采集血流動力學數(shù)據(jù)，實驗中選取平衡灌注30 min(Baseline)和再灌注120 min(R120)兩個時間點，記錄分析冠脈流量(coronary flow，CF)、左室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)，并收集冠脈流出液，使用全自動生化分析儀測定LDH和CK-MB活性。

1.6TUNEL法檢測心肌細胞凋亡水平心臟復灌120min后，取左心室組織，4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋并切片，按TUNEL試劑盒操作，用熒光顯微鏡觀察心肌細胞凋亡情況，具體實驗操作參考DeadEedTMFluorometric TUNEL檢測試劑盒說明書。

1.7電鏡下觀察大鼠心肌細胞超微結構改變及自噬體心臟復灌120 min后，取左心室組織，用戊二醛及鋨酸雙重固定, 乙醇丙酮逐級脫水, 環(huán)氧樹脂包埋, LKB-V型超薄切片機制備超薄切片，超薄切片機切片, 醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察心肌細胞中的超微結構改變，并尋找心肌細胞內(nèi)自噬體，并計數(shù)一銅網(wǎng)孔(約30 000 μm2)內(nèi)自噬體數(shù)量，每個樣本計數(shù)3個銅孔，取平均值。

1.8Western blot法檢測心肌細胞中自噬相關蛋白實驗結束后，取心尖及左心室部分用RIPA 200 μL充分裂解提取蛋白, BCA法測樣品蛋白濃度, 均衡每組蛋白濃度后, 以SDS-PAGE 凝膠電泳分離。半干法轉移蛋白至 PVDF 膜, 5%脫脂奶粉封閉過夜, 加入LC3抗體和Beclin 1抗體(1 ∶1 000) 于 4℃封閉袋中孵育過夜, 二抗室溫孵育1 h。ECL化學發(fā)光法顯示結果, 壓片曝光，拍照, 并對目的條帶進行灰度分析，結果用目標條帶與內(nèi)參的比值表示。

2結果

2.1葒草苷對I/R損傷大鼠心臟血流動力學指標的影響如Tab1所示，與Control組比較，缺血后再灌注120 min能明顯引起大鼠離體心臟血流動力學指標變化：CF、LVDP、+dp/dtmax及-dp/dtmax均有不同程度下降(P<0.01)；而葒草苷能明顯改善I/R大鼠心臟的血流動力學指標，與I/R組比較，差異有顯著性，初步表明葒草苷能改善I/R損傷引起的心功能障礙；與Ori-2組比較，加用自噬抑制劑渥曼青霉素后，I/R大鼠心臟的LVDP及±dp/dtmax數(shù)值則明顯降低(P<0.01)。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsI/R group;△P<0.05,△△P<0.01vsori-2 group

2.2葒草苷對I/R損傷大鼠心臟心肌酶漏出的影響如Tab2所示，與Control組相比，I/R大鼠心臟冠脈流出液中LDH及CK-MB漏出率明顯升高(P<0.01)；而葒草苷能明顯減少I/R大鼠心肌冠脈流出液中的LDH和CK-MB水平(P<0.01)，且呈一定的劑量依賴性，表明葒草苷能減輕I/R損傷引起的心肌損傷；與Ori-2組比較，OW組大鼠心臟冠脈流出液中LDH及CK-MB水平又明顯升高(P<0.01)，表明渥曼青霉素抑制了葒草苷對I/R損傷心肌的保護作用。

2.3葒草苷對I/R損傷大鼠心肌細胞超微結構改變的影響Control組大鼠的正常心肌細胞超微結構如Fig 1A所示：心肌纖維排列整齊且緊密，肌小節(jié)結構清晰可見，線粒體嵴豐富且完整，心肌間質(zhì)無異常變化。I/R大鼠心肌細胞中心肌纖維排列紊亂且肌纖維溶解斷裂；線粒體腫脹，基質(zhì)稀疏，嵴密度降低，表明I/R引起了心肌細胞嚴重損傷。而葒草苷對I/R損傷導致的大鼠心肌細胞超微結構改變具有明顯改善作用，大鼠心肌中肌原纖維排列整齊，肌小節(jié)完整，線粒體大小形態(tài)基本正常。在OW組中電鏡觀察顯示其心肌細胞中肌纖維紊亂，部分肌絲溶解斷裂，線粒體腫脹，嵴稀疏紊亂，進一步提示渥曼青霉素減弱了葒草苷對I/R心肌細胞的保護作用。

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsOri-2 group

Fig 2Orientin suppressed apoptosis of cardiomyocytes induced by MIRI

##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsOri-2 group

2.4葒草苷對I/R損傷大鼠心肌細胞凋亡的影響由Fig 2可知，與Control組比較，心肌細胞I/R損傷能明顯誘導心肌細胞凋亡(P<0.01)；而葒草苷能明顯抑制I/R損傷引起的心肌細胞凋亡，其中高劑量葒草苷的抑制效果更明顯(P<0.01)。與Ori-2組比較，OW組的凋亡水平又明顯上升(P<0.01)，表明渥曼青霉素減弱了葒草苷的抗細胞凋亡作用。

2.5葒草苷對I/R損傷大鼠心肌細胞自噬的影響電鏡下觀察到心肌細胞內(nèi)出現(xiàn)雙層膜或單層膜結構內(nèi)包含細胞器的自噬泡是鑒別細胞發(fā)生自噬的金標準[12]。Fig 3A為Ori-2組心肌細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的不同階段自噬體。其中1和2為早期自噬體：雙層膜結構內(nèi)包裹有線粒體；3～6可能為晚期自噬體，即自噬溶酶體：單層膜內(nèi)包裹有待降解的細胞器和細胞質(zhì)。此外，本研究還對心肌細胞內(nèi)自噬體的數(shù)量進行了統(tǒng)計(Fig 3B)，在中高劑量葒草苷組中自噬體的數(shù)量有明顯增加的趨勢(差異無統(tǒng)計學意義)，這提示葒草苷可能增強了細胞內(nèi)的自噬程度。

如Fig 3C～E所示，與Control組比較，在I/R組大鼠心肌細胞內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例及Beclin 1的表達水平都有上升的趨勢，表明I/R損傷可誘導細胞自噬；而在葒草苷組大鼠心肌細胞內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例和Beclin 1的表達水平進一步增強，表明葒草苷可明顯誘導自噬增強；與Ori-2組比較，在OW組大鼠心肌細胞內(nèi)渥曼青霉素抑制了LC3-I向LC3-II的轉化以及Beclin 1的表達，說明渥曼青霉素能抑制葒草苷誘導的心肌細胞自噬。

Fig 3Orientin pretreatment induced autophagy

A: Transmission electron micrographs of the myocardium of orientin (2 mg·kg-1)-treated samples showing autophagosomes (arrows)； B： Quantification of the number of autophagosomes； C： Westernblot was performed with myocardial tissue lysate for expression of

Autophagic marker proteins； D： Quantification of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ was performed by using the immunoreactive bands with QuantiOne imaging software (Biorad); E: Quantification of Beclin 1 was performed by using the immunoreactive bands with QuantiOne imaging software (Biorad).##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsOri-2 group.

3討論

心肌I/R發(fā)生時，易引發(fā)心功能障礙，血流動力學指數(shù)異常；而心肌酶(如LDH和CK-MB)的漏出量以及心肌細胞超微結構改變也是反映心肌損害程度的重要指標。在本實驗中，葒草苷可明顯緩解I/R引起心功能障礙，減少心肌酶的漏出，減輕心肌細胞超微結構改變，這表明葒草苷可以增強I/R后心肌功能，減輕I/R引起的心肌細胞損傷，對心肌I/R損傷有一定的預防作用。

研究認為，細胞凋亡參與了心肌I/R損傷的病理過程。心肌缺血和再灌注均可引起心肌細胞凋亡[13-14]，對心臟造成不可逆的損傷，因此，細胞凋亡常被認為是心肌I/R損傷一個明顯特征。前期研究表明，葒草苷的抗心肌I/R損傷的作用機制與其能抑制細胞凋亡有關，如付曉春等[10]通過建立心肌細胞缺氧/復氧損傷模型及心肌缺血/再灌損傷模型，發(fā)現(xiàn)葒草苷主要是通過阻止線粒體細胞凋亡途徑激活來抑制心肌細胞缺氧/復氧和心肌缺血/再灌誘導的細胞凋亡；而盧娜等[11]則通過建立H9C2心肌細胞缺氧/復氧損傷模型，也發(fā)現(xiàn)葒草苷可明顯降低缺氧/復氧損傷誘導的細胞凋亡。本實驗結果表明，預給藥葒草苷也能通過抑制細胞凋亡來減輕心肌I/R損傷，因此，抗細胞凋亡是葒草苷抗心肌I/R損傷的主要作用機制之一。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，細胞自噬是一種與細胞凋亡不同又相關的細胞保護機制，也與心肌I/R損傷密切相關。細胞自噬是一個進化上高度保守的細胞內(nèi)降解過程，主要用于降解細胞內(nèi)長壽命或過度表達蛋白質(zhì)以及受損細胞器。在正常生理條件下，自噬在細胞內(nèi)是持續(xù)低水平進行的；但當細胞處于應激狀態(tài)時，如饑餓脅迫、低氧環(huán)境或遭遇病原體感染等，自噬可被明顯誘導。研究證明，心肌缺血、再灌注(或缺氧、復氧)均可誘導細胞自噬上調(diào)[4,15]。且研究進一步表明，自噬在心肌I/R損傷中起“雙刃劍”作用：即在缺血期，心肌缺血缺氧可激活細胞自噬而對缺血心肌起保護作用；但在再灌注期，細胞自噬得到進一步增強，然而過度自噬會引起心肌細胞死亡，反而對心肌起損傷作用[4,15-16]。由于細胞自噬在本質(zhì)上仍是一種促細胞存活機制[17]，因此自噬的調(diào)控將決定其“雙刃劍”的走向，自噬程度可能是其“雙刃劍”作用的核心。目前，細胞自噬已成為抗心肌I/R損傷的一個新靶點。

LC3和Beclin 1是自噬體膜上的標志物，其中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例以及Beclin 1的表達水平與細胞內(nèi)自噬水平成正比。在本實驗中，葒草苷可明顯誘導細胞自噬相關蛋白LC3II和Beclin 1表達上升，且增加心肌細胞內(nèi)自噬體數(shù)量，這初步表明葒草苷誘導的細胞自噬對I/R損傷的心肌細胞起保護作用。由于渥曼青霉素是磷脂酰肌醇，-3激酶(PI3K)抑制劑，常用作自噬的抑制劑，因此本研究還通過加用渥曼青霉素的方法，進一步考察葒草苷抗心肌I/R損傷的保護作用與自噬的關系。在本實驗中，與Ori-2組大鼠比較，OW組大鼠的血流動力學指標異常，LDH和CK-MB漏出量增加，心肌細胞超微結構出現(xiàn)病理學變化，表明渥曼青霉素在一定程度上減弱了葒草苷對心肌I/R損傷的保護性作用，也進一步證明了葒草苷的心肌細胞保護作用可能與細胞自噬有關，但其具體作用機制需進一步深入研究。

此外，本研究還表明：在I/R中，細胞自噬和細胞凋亡存在著復雜的相互作用。例如，在Ori-2組，I/R大鼠心肌細胞內(nèi)自噬水平升高，而凋亡程度下降；而用渥曼青霉素抑制葒草苷誘導的細胞自噬后，細胞凋亡率又明顯上升。這初步表明葒草苷能通過誘導細胞自噬來抑制細胞凋亡，但其具體作用機制仍需進一步探究。

綜上所述，葒草苷對大鼠心臟I/R損傷具有明顯保護作用，其保護機制可能與降低心肌細胞凋亡及增強細胞自噬有關。

(致謝：本文實驗在北京市中央民族大學中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學國家民委-教育部重點實驗室完成，在此表示衷心感謝！)

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Cardioprotection of orientin against myocardial ischemia reperfusion injury through induction of autophagy

LIU Li-ya1,2, WANG Hui-ye1, HUANG Xiu-lan1

(1.StateNationalitiesAffairsCommissionandDeptofEducationalKeyLabofMinorityTraditionalMedicine,2.CollegeofLifeandEnvironmentalSciences,MINZUUniversityofChina,Beijing100081,China)

Key words:orientin; myocardial ischemia reperfusion injury; autophagy; apoptosis; LC3; Beclin 1

Abstract:AimTo investigate the role of autophagy in the cardioprotection by orientin and the relative molecular mechanisms in cell apoptosis and autophay.MethodsThe isolated ischemia reperfusion (I/R) heart model was built firstly. The Experiments were divided into seven groups: control group, I/R group, different concentrations of orientin-treated group(1.0 mg·kg-1，2.0 mg·kg-1，4.0 mg·kg-1), autophagy inhibitor group and resveratrol group. Hemodynamic index were recorded by PowerLab, the activities of myocardial enzymes were detected through Biochemical analyzer, the ultrastructure changes and autophagosomes in myocardial cells were detected by electron microscopy, the apoptosis was detected by TUNEL, and LC3 and Beclin1 protein levels of left ventricle were measured by Western blot.ResultsOrientin at middle and high concentrations(2 and 4 mg·kg-1) induced autophagy shown by increased the number of autophagosomes, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio and Beclin 1 expression after ischemia-reperfusion. The induction of autophagy by orientin was correlated with enhanced cardiac function and decreased apoptosis. But wortmannin, a kind of autophagy inhibitor, significantly attenuated the orientin-induced autophagy and increased apoptosis.ConclusionThe cardioprotection of orientin against myocardial ischemia reperfusion injury may be mediated through the inhibition of apoptosis and induction of autophagy.

收稿日期:2015-12-20,修回日期:2016-02-11

基金項目：國家自然科學基金面上項目(No 81173656)

作者簡介：劉立亞(1980-)，男，博士，研究方向：中藥/民族藥心血管藥理學，E-mail: sclar@muc.edu.cn; 黃秀蘭(1964-)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：中藥/民族藥心血管藥理學，通訊作者，Tel: 010-68933254, E-mail: hxlcun@126.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.020

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0542-06

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R329.24；R329.21；R542.201

網(wǎng)絡出版時間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.040.html