朱　玲，王穎婉，李葉麗，錢志強(qiáng)，楊　華，楊丹莉

(1.遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州 遵義　563000)

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淫羊藿苷抗自發(fā)性高血壓大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用

朱玲1，王穎婉1，李葉麗1，錢志強(qiáng)1，楊華2，楊丹莉1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州 遵義563000)

摘要：目的觀察淫羊藿苷(icariin，Ica)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，探討其可能的機(jī)制。方法將21只14周齡♂ SHR隨機(jī)分為模型組，Ica低、高劑量組(20、40 mg·kg-1，ig，bid，至26周齡)，14周齡♂ 同源京都大鼠(WKY)為對(duì)照組，各組動(dòng)物數(shù)均為7只。WKY組、模型組同期灌胃等體積雙蒸水。采用HE染色觀察腎臟病理學(xué)變化；原位缺口末端標(biāo)記法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡；real time RT-PCR法檢測(cè)腎Bok、Bcl-2、Bax mRNA水平；Western blot法檢測(cè)腎Bcl-2、Bax、Active caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果與WKY組相比，模型組腎小球囊腔狹窄且不規(guī)則，腎小球系膜基質(zhì)增多，細(xì)胞排列紊亂，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，個(gè)別腎小球出現(xiàn)皺縮，腎小管上皮細(xì)胞水腫、管腔狹窄；腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯，Bok 和Bax mRNA水平、Bax和Active caspase-3蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，Bcl-2 mRNA和蛋白的水平明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，Ica-L組、Ica-H組腎小球囊腔增寬，腎小球系膜基質(zhì)增生減少，細(xì)胞排列紊亂有所改善，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、腎小管管腔狹窄均減輕；腎小管上皮細(xì)胞凋亡以及 Bok、Bax mRNA水平和Bax蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，Ica-H組腎Bcl-2 mRNA水平和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Active caspase-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論淫羊藿苷可抑制SHR腎小管上皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)Bax、Active caspase-3、Bok，上調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：淫羊藿苷；自發(fā)性高血壓大鼠；凋亡；Bcl-2；Bax；Active caspase-3

高血壓是心腦血管疾病發(fā)病與死亡的危險(xiǎn)因素。腎臟既是引起高血壓的重要器官，也是高血壓損害的靶器官。高血壓性腎損害指原發(fā)性高血壓所導(dǎo)致的腎臟小動(dòng)脈或腎實(shí)質(zhì)的損害，是一個(gè)長(zhǎng)時(shí)持續(xù)的過程，為高血壓病的主要并發(fā)癥。原發(fā)性高血壓腎損害發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要原因?yàn)檠芑钚晕镔|(zhì)平衡失調(diào)和腎小動(dòng)脈硬化導(dǎo)致的腎血流動(dòng)力學(xué)異常[1]。有研究報(bào)道，原發(fā)性高血壓是引起高血壓腎損傷并導(dǎo)致終末期腎衰竭的重要病因之一[2]，在高血壓的進(jìn)程中引起的腎臟損傷與腎小管上皮細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、能量代謝有關(guān)[3-4]。Ica是淫羊藿的主要活性成分之一。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，Ica具有改善心腦血管功能、增強(qiáng)免疫功能、抗心肌細(xì)胞凋亡、抗SHR腎纖維化等作用[5-7]。故本研究擬用SHR的腎為研究對(duì)象，觀察Ica對(duì)SHR腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。

本研究使用14周齡♂ SHR，給予Ica灌胃至26周齡，采用HE染色觀察腎臟病理學(xué)變化，觀察Ica是否具有改善高血壓腎損害的作用。采用TUNEL法觀察Ica對(duì)SHR腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。在確證其具有抗SHR腎小管上皮細(xì)胞作用的基礎(chǔ)上，采用real time RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)腎Bcl-2、Bax、Bok、Active caspase-3的mRNA或蛋白變化，研究其抗凋亡的作用機(jī)制，旨在為Ica用于SHR腎損害的治療提供基礎(chǔ)藥理學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器淫羊藿苷(純度≥98%)購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光混合物、β-actin、Bcl-2、Bax、Bok引物購(gòu)自TaKaRa生物工程公司；RNA擴(kuò)增儀，美國(guó)Eppendorf公司；Bcl-2、Bax、Active caspase-3兔抗鼠抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的β-actin抗體購(gòu)自上?？党缮锛夹g(shù)有限公司；ECL發(fā)光劑，七海生物有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)，德國(guó)ROCHE公司；Mini-PROTEAN3電泳儀、real time RT-PCR擴(kuò)增儀、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、CCD成像系統(tǒng)，美國(guó) BIO-RAD公司；Olympus光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)，日本Olympus公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本制備14周齡的♂ SHR大鼠21只、WKY 大鼠7只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。SHR大鼠隨機(jī)均分為3組，分別為模型組(n=7)、Ica低劑量組(20 mg·kg-1,n=7)和Ica高劑量組(40 mg·kg-1,n=7)，WKY大鼠作為對(duì)照組(n=7)。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，Ica低劑量組與Ica高劑量組分別給予Ica 20、40 mg·kg-1，ig，bid至26周齡，模型組和對(duì)照組給予等體積雙蒸水，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，取標(biāo)本備用。

1.3腎臟病理學(xué)給藥至26周齡后，7%水合氯醛(0.35 g·kg-1)經(jīng)腹腔注射麻醉成功后，取各組大鼠腎臟組織，置于4%甲醛溶液中固定48 h后，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟病理學(xué)的形態(tài)變化。

1.4腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)TUNEL法測(cè)定腎小管上皮細(xì)胞凋亡，光學(xué)顯微鏡下觀察每組腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況，正常細(xì)胞核顯藍(lán)色，凋亡陽性細(xì)胞核呈棕黃色，計(jì)算每400倍放大視野凋亡細(xì)胞數(shù)目與細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.5Real-time RT-PCR法檢測(cè)大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、Bok mRNA的表達(dá)取各組腎組織，置于1ml TRIzol中提取總RNA并純化，經(jīng)兩步法-聚合酶鏈反應(yīng)分別檢測(cè)β-actin、Bcl-2、Bax、Bok mRNA的表達(dá)。所檢測(cè)基因的引物序列參照GenBank中大鼠β-actin、Bcl-2、Bax、Bok序列設(shè)計(jì)，見Tab1。目的基因表達(dá)用相對(duì)定量法：以PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閡值所需要的循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct值)為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，依次計(jì)算下列數(shù)據(jù)，Ct值的平均值=(Ctl+Ct2)/2(重復(fù)管)；dCt=Ct值的平均值-中間值(相同檢測(cè)基因的不同樣品Ct值的平均值中居中的值)；基因的表達(dá)=2-dct；相對(duì)定量=目的基因的表達(dá)/內(nèi)參基因的表達(dá)×100，將WKY組的mRNA表達(dá)設(shè)為100。

1.6Western blot法檢測(cè)腎臟組織中Bcl-2、Bax、Active caspase-3的表達(dá)取各組大鼠腎臟組織約0.1 g，剪碎后放入1 mL RIPA裂解液中，加入PMSF 10 μL，冰上勻漿后靜置30 min，4℃離心12 000 r·min-1，20 min，取上清液，BCA法測(cè)定待測(cè)樣品的總蛋白濃度。每孔上樣量為30 μg蛋白配置為10 μL上樣體系，SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上層5%濃縮膠，下層12%分離膠。電泳后采用Bio-Rad Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%蛋白封閉液封閉2.5 h，TBST洗膜10 min×3次，一抗結(jié)合：β-actin(1 ∶5 000)、Bcl-2(1 ∶200)、Bax(1 ∶1 000)、Active caspase-3(1 ∶2 000)4℃ 過夜；TBST洗膜10 min×3次，兔二抗(1 ∶2 000)，常溫浸泡1.5 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，Bio-Rad CCD成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA處理，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett，T3法,P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1腎臟病理學(xué)HE染色顯示W(wǎng)KY組腎小球毛細(xì)血管管腔開放良好，系膜基質(zhì)及細(xì)胞無明顯增生，腎小球囊無滲出。與WKY組比較，模型組腎小球囊腔狹窄且不規(guī)則，腎小球系膜基質(zhì)增多，細(xì)胞排列紊亂，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，個(gè)別腎小球出現(xiàn)皺縮，腎小管上皮細(xì)胞水腫，管腔狹窄；與模型組比較，Ica-L組腎小球囊腔略增寬，腎小球系膜基質(zhì)減少，部分毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，細(xì)胞排列紊亂有所改善，腎小管管腔狹窄不明顯；Ica-H組腎小球囊腔明顯增寬，腎小球系膜基質(zhì)無明顯增生，細(xì)胞排列良好，毛細(xì)血管管腔開放良好，腎小管結(jié)構(gòu)正常，見Fig 1。

2.2腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)與WKY組比較，模型組腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯(P<0.01)，腎臟內(nèi)凋亡陽性細(xì)胞主要見于腎小管上皮細(xì)胞和腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞；與模型組比較，Ica-L組低、Ica-H組腎小管上皮細(xì)胞凋亡減少(P<0.01)，見Tab2，F(xiàn)ig 1。

2.3腎臟組織Bok、Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)與WKY組比較，模型組Bok、Bax mRNA的水平均明顯上調(diào)(P<0.01)，Bcl-2 mRNA的水平明顯下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，Ica-L、Ica-H組Bok、Bax mRNA的水平均明顯下調(diào)(P<0.01)，Ica-H組Bcl-2 mRNA的水平明顯上調(diào)(P<0.01)，Ica-L組Bcl-2 mRNA的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 2。

2.4腎臟組織中Bcl-2、Bax、Active caspase-3蛋白的表達(dá)與WKY比較，模型組Bax、Active caspase-3蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，Ica-L、Ica-H組Bax蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.01)，Ica-H組Active caspase-3蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，Ica-L組Active caspase-3蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Ica-H組Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，Ica-L組Bcl-2蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 3。

A:WKY; B:Model; C:Ica-L; D:Ica-H，the scale is 50 um, and solid arrows indicate renal cysts, otherwise hollow arrows indicate mesangial matrix ; TUNEL solid arrow indicates the apoptotic cells

Tab2Apoptotic percentage of renal tubular epithelial

##P<0.01vsWKY；**P<0.01vsmodel

##P<0.01vsWKY；**P<0.01vsmodel

#P<0.05，##P<0.01vsWKY；*P<0.05，**P<0.01vsmodel

3討論

SHR的發(fā)病機(jī)制和病理與人類高血壓病相似，是目前研究原發(fā)性高血壓應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物模型。本研究結(jié)果顯示，與WKY組比較，SHR出現(xiàn)明顯的高血壓腎損害的病理改變，說明26周齡的SHR已出現(xiàn)腎損害。該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室既往研究揭示的26周齡SHR出現(xiàn)腎損害的報(bào)道一致[7]。本研究中，Ica明顯改善26周齡SHR的腎損害。有研究報(bào)道，Ica可減輕大鼠腎臟缺血/再灌注損傷[8]。

目前研究已證實(shí)，細(xì)胞凋亡參與了高血壓靶器官損害，并在調(diào)節(jié)靶器官細(xì)胞數(shù)量，保護(hù)器官功能方面發(fā)揮著非常重要作用[9]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)性、程序性死亡的過程。已有研究報(bào)道，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡可加重SHR、腎缺血/再灌注損傷等腎損害[8,10]。本研究TUNEL染色結(jié)果顯示，模型組腎臟發(fā)生細(xì)胞凋亡且凋亡細(xì)胞主要為腎小管上皮細(xì)胞，而Ica-L、Ica-H組腎臟細(xì)胞凋亡減少，特別是腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯減少，提示Ica具有抗腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用。

線粒體通路在細(xì)胞存亡機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，尤其Bcl-2蛋白家族和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)家族目前最受關(guān)注。Bcl-2家族成員按其功能可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩種，Bcl-2是主要的抗凋亡蛋白，Bax、Bok是促凋亡蛋白，而Bax是促凋亡代表成員。已有研究表明，Bax和Bcl-2都是以線粒體為靶細(xì)胞器發(fā)揮作用[11-12]。Bax蛋白多以非活性單體形式分布于胞質(zhì)中，只有在接收到凋亡信號(hào)刺激被激活后，發(fā)生分子構(gòu)象改變，移位并插入線粒體外膜后形成Bax 大孔道，破壞線粒體膜的完整性，并與Bcl-2 等抑制凋亡的蛋白對(duì)抗，阻止其抗凋亡作用的發(fā)揮[13]。caspase-3是ICE(白細(xì)胞介素1-β轉(zhuǎn)化酶) 家族成員之一，又稱為半胱氨酸蛋白酶32(CPP32)，與Ced-3同源性最高，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，在細(xì)胞凋亡過程中占據(jù)核心地位，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”[14]。Bcl-2、Bax蛋白位于線粒體上游，是線粒體膜的通透性改變的重要調(diào)控因素[15]，其過度表達(dá)能控制cyt-C的釋放和下游 caspase-3蛋白酶的活化，介導(dǎo)細(xì)胞的存活或死亡[16]。

淫羊藿系小檗科淫羊藿屬植物，具有補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕的功效。有研究報(bào)道，Ica具有抗生殖細(xì)胞凋亡的作用[17]，Ica還可通過抑制caspase-3激活減輕SHR心肌細(xì)胞凋亡[6]，在5/6腎切除大鼠模型中，Ica通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)，改善腎臟功能[18]。本研究結(jié)果顯示，與WKY組比較，模型組Bok、Bax mRNA的水平以及Bax、Active caspase-3蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2 mRNA的水平以及Bcl-2蛋白的表達(dá)下調(diào)，提示腎組織Bcl-2、Bax、Active caspase-3、Bok表達(dá)的變化可能參與SHR腎損害的發(fā)生發(fā)展。Ica-L、Ica-H組Bok、Bax mRNA和Bax蛋白，Ica-H組Active caspase-3蛋白的表達(dá)均低于模型組，而Ica-H組Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)均高于模型組，提示Ica可能通過抑制腎組織的Bax、Bok、Active caspase-3的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)從而發(fā)揮抗SHR腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用。

綜上，Ica對(duì)SHR腎損害的保護(hù)作用至少與其抑制其腎小管上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)，其機(jī)制可能是抑制Bax、Bok、Active caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)。本研究為中藥淫羊藿的主要活性成分Ica用于腎損害的治療提供基礎(chǔ)藥理學(xué)依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)所有工作均在遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝教研室的支持和幫助，感謝王俊逸、華亮、吳芹、高楊等提供的無私幫助！)

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Anti-apoptotic effect of Icariin on renal tubular epithelial cell in SHR

ZHU Ling1, WANG Ying-wan1, LI Ye-li1, QIAN Zhi-qiang1, YANG Hua2，YANG Dan-li1

(1.DeptofPharmacologyandKeyLaboratoryforBasicPharmacologyofMinistryofEducation,ZunyiMedicalCollege,ZunyiGuizhou563000,China;2.AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,ZunyiGuizhou563000，China)

Key words:Icariin; spontaneously hypertensive rats; apoptosis, Bcl-2；Bax；Active caspase-3

Abstract:AimsTo observe the effect of Icariin(Ica) on apoptosis of renal tubular epithelial cell in spontaneously hypertensive rats(SHR), and to explore its possible mechanism.Methods21 male SHR of 14 weeks were randomly divided into model groups, the Ica low and high dose groups (20 or 40 mg·kg-1，ig, bid, to 26 weeks), 14 week-old male homologous Kyoto rats(WKY) as control group, and the number of each group was 7. WKY group and model group were administered by gavage with the same volume of double distilled water. The pathological changes were observed by using the HE staining and the apoptosis was detected by TUNEL method in renal tubular epithelial cell, respectively. The mRNA levels of Bok, Bax, Bcl-2 were detected by the real time RT-PCR and the protein expressions of Bcl-2, Bax and Active caspase-3 were detected by Western blot method in the renal tissue.ResultsCompared with WKY, renal capsule was narrow and irregular, and glomerular mesangial matrix was increased with the cell arrangement disorder and the capillary dilation and congestion. Several glomeruli shrank and renal tubular epithelial cell was edema with luminal stenosis in model group. The apoptosis of renal tubular epithelial cell was evident and the mRNA levels of Bok and Bax, as well as the protein expressions of Bax and Active caspase-3 were significantly up-regulated in model group, while the mRNA Level and protein expression of Bcl-2 significantly down-regulated(P<0.05 orP<0.01).Compared with model group, renal glomerular capsule widened, proliferation of glomerular mesangial matrix was reduced, and cell arrangement disorder and capillary dilation and renal tubular lumen stenosis were improved in Ica group. Renal tubular epithelial cell apoptosis was decreased evidently, and the mRNA level of Bax, Bok and protein expression of Bax were significantly down-regulated in Ica group, and the mRNA level and protein expression of Bcl-2 in Ica-H group were significantly up-regulated while the protein expression of Active caspase-3 significantly down-regulated(P<0.05 orP<0.01).ConclusionIca can inhibit the apoptosis of renal tubular epithelial cell in spontaneously hypertensive rats and its mechanism may be related to the down-regulation of Bok, Bax, and Active caspase-3, accompanied with the up-regulation of Bcl-2.

收稿日期:2016-01-11,修回日期:2016-02-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)專項(xiàng)基金(No 81241142)

作者簡(jiǎn)介：朱玲(1990-)，女，碩士，研究方向：心血管藥理學(xué)、抗炎免疫藥理學(xué)，E-mail：lingluhappy@foxmail.com； 楊丹莉(1971-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)、抗炎免疫藥理學(xué)， 通訊作者，Tel: 0851-28609616, E-mail：zmuyangdanli@foxmail.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.019

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)04-0537-05

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R284.1；R322.61；R329.25；R544.1

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.038.html