馬增春，肖　勇，趙佳偉,2，王宇光，譚洪玲，梁乾德，湯響林，肖成榮，楊　凌，高　月

(1. 軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京　100850；2.安徽醫(yī)科大學研究生學院，安徽 合肥　230032;3. 南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院海勤療養(yǎng)區(qū)，浙江 杭州　310002)

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人參皂苷Re對H9c2心肌細胞CYP450酶的影響

馬增春1，肖勇1，趙佳偉1,2，王宇光1，譚洪玲1，梁乾德1，湯響林1，肖成榮1，楊凌3，高月1

(1. 軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京100850；2.安徽醫(yī)科大學研究生學院，安徽 合肥230032;3. 南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院海勤療養(yǎng)區(qū)，浙江 杭州310002)

摘要:目的觀察人參皂苷Re對H9c2心肌細胞色素P450酶的影響，旨在發(fā)現(xiàn)人參皂苷Re對心肌細胞作用的分子機制。方法實驗分對照組、人參皂苷Re各劑量組(1、5、10、50、100 μmol·L-1)處理組，人參皂苷Re作用6、24、36、48及60 h后提取RNA或蛋白進行測定。利用實時定量PCR法檢測H9c2心肌細胞CYP2C11、CYP2J3、CYP4A1、CYP4A3、CYP4F4及ANP mRNA的表達；采用Western blot法檢測心肌細胞CYP4A1和CYP2J3蛋白的表達。結(jié)果人參皂苷Re明顯上調(diào)心肌細胞CYP2C11、CYP2J3 mRNA的表達至正常對照的1.6、1.8倍，明顯下調(diào)CYP4A1、CYP4A3及CYP4F4 mRNA的表達至正常對照的0.4、0.15、0.3倍。人參皂苷Re明顯上調(diào)ANP基因表達水平至正常對照的3.2倍。隨著藥物濃度的增加，人參皂苷Re對CYP4A1蛋白表達產(chǎn)生明顯的下調(diào)作用，而對CYP2J3蛋白產(chǎn)生明顯的上調(diào)作用。結(jié)論人參皂苷Re可影響心肌細胞的CYP450酶和ANP基因的表達。

關(guān)鍵詞:人參皂苷Re；心肌細胞；利鈉肽；細胞色素P450酶；CYP2J3；CYP4A1

人參皂苷Re (ginsenoside Re)是中藥人參中的主要有效成分，研究表明，人參皂苷Re具有較強的抗心肌缺血作用，可增加心肌供氧量，使心率明顯降慢[1]。人參皂苷Re減少心肌細胞凋亡，對心肌缺血/再灌注損傷有防治作用[2]。細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450) 酶是人體最重要的代謝酶，參與生物體內(nèi)源性物質(zhì)(如類固醇激素、花生四烯酸等) 和外源性物質(zhì)( 如藥物、環(huán)境致癌物等)的生物轉(zhuǎn)化[3]，CYP450酶包括表氧化酶和羥化酶兩種，CYP2C和CYP2J兩類CYP450表氧化酶可將花生四烯酸代謝生成環(huán)氧二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids, EETs)[4]。CYP4A和CYP4F兩類CYP450羥化酶可將花生四烯酸代謝生成羥化環(huán)氧二十碳三烯酸(hydroxyeicosatrienoic acids, HETEs)[5]。EETs促血管生成、舒張血管，對心血管有著積極的保護作用[6]。而20-HETE的生物學效應與EETs相反，收縮冠脈血管，并通過抑制肌纖維膜ATP敏感性K+通道介導心肌損傷[7]。H9c2細胞常作為心肌損傷保護的體外研究模型，人參皂苷Re能否通過誘導或抑制CYP450酶的表達，以改變EETs和HETEs之間的體內(nèi)代謝平衡，從而發(fā)揮其心肌保護作用。本文將通過檢測人參皂苷Re對心肌細胞CYP450酶的影響來探討其對心肌細胞的作用機制。

1材料

1.1細胞H9c2心肌細胞購于中國醫(yī)學科學院協(xié)和細胞中心，由本實驗室培養(yǎng)并保存。

1.2藥品與試劑人參皂苷Re，20 mg，批號：11179-200702。DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸(NEAA)、胎牛血清(Hyclone公司)；TRIzol和引物購于Invitrogen(Carlsbad，California，USA)。CYP4A1、CYP2J3抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，GAPDH抗體購自Cell Signaling公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG (H+L)為Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品。ECL檢測系統(tǒng)為北京普利來公司產(chǎn)品。PVDF膜購自Millipore Biosciences。引物序列如Tab1所示。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)購得H9c2心肌細胞后，倒掉原培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次，加入0.25%胰酶室溫消化約3 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，H9c2細胞培養(yǎng)瓶置37 °C，5% CO2，飽和濕度的恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。人參皂苷Re劑量效應處理濃度為0.1、1、10、50、100 μmol·L-1，檢測時間為作用48 h。人參皂苷Re時間效應為作用后6、24、36、48及60 h，作用濃度為10 μmol·L-1。

2.2實時定量PCR檢測人參皂苷Re對CYP450 mRNA表達的影響取H9c2心肌細胞，以細胞數(shù)2×105/孔接種于6孔板中。同時設(shè)立0.1% DMSO的溶劑對照，藥物處理H9c2大鼠心肌細胞不同時間點提取細胞總RNA。用紫外分光光度計(Beckman DU-600) 檢測RNA濃度和純度(OD260/OD280值為1.8～2.0)。按Real time PCR試劑盒說明書操作檢測CYP450 mRNA及GDPAH。RT的反應條件為42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。PCR 的反應條件為94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)。

2.3Western blot檢測人參皂苷Re對CYP450蛋白表達的影響H9c2大鼠心肌細胞處于指數(shù)生長期，換0.1% FBS的DMEM培養(yǎng)24 h使細胞同步化，然后按實驗分組，加入不同的處理因素繼續(xù)孵育至所需時間。按說明書提取細胞總蛋白定量，每孔40 μg蛋白上樣，進行電泳，半干式電轉(zhuǎn)至 PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后加一抗(CYP4A1為 1 ∶2 000)，4 ℃過夜后洗膜，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶2 000)室溫下輕微搖晃孵育 1 h，暗室中進行壓片、顯影、定影，洗片晾干后用Alphalmager TM 2200進行圖像分析，檢測密度掃描值。

3結(jié)果

3.1人參皂苷Re對H9c2心肌細胞CYP基因表達的影響人參皂苷Re劑量效應處理濃度為0.1、1、10、50、100 μmol·L-1，檢測時間為作用48 h。人參皂苷Re時間效應為加藥作用后6、24、36、48及60 h，作用濃度為10 μmol·L-1。與對照組比較，人參皂苷Re明顯上調(diào)心肌細胞CYP2C11、CYP2J3 mRNA的表達至正常對照的1.6、1.8倍；人參皂苷Re對ω-羥化酶CYP4A1基因表達水平有明顯下調(diào)作用，CYP4A1基因表達水平下調(diào)至正常對照的0.4倍。人參皂苷Re時間效應的研究結(jié)果表明，隨著處理時間增加，人參皂苷Re對CYP2C11、CYP2J3基因表達水平明顯上調(diào)至正常對照的2.5、2.7倍；然而，對CYP4A1基因表達水平明顯下調(diào)至正常對照的0.45倍。

3.2人參皂苷Re對H9c2細胞CYP450蛋白表達的影響

人參皂苷Re處理的細胞樣品CYP4A1蛋白表達水平的檢測結(jié)果如Fig 2所示，結(jié)果顯示人參皂苷Re在濃度為1 μmol·L-1時CYP4A1 蛋白表達水平有所減少，而50 μmol·L-1與對照組比較，對CYP4A1 蛋白表達產(chǎn)生明顯的下調(diào)效應，人參皂苷Re濃度依賴性下調(diào)CYP4A1的表達，在100 μmol·L-1時表達量達到最小。人參皂苷Re對CYP2J3蛋白表達的影響如Fig 3所示，人參皂苷Re促進了CYP2J3蛋白的表達，且作用具有濃度依賴性。

3.3人參皂苷Re對H9c2細胞ANP基因表達的影響結(jié)果如Fig 4顯示，人參皂苷Re能夠明顯上調(diào)ANP基因表達至正常對照的3.2倍。提示人參皂苷Re可能促進心肌細胞釋放ANP。

4討論

CYP450酶通過調(diào)控Ca2+通道以及心肌細胞的收縮，CYP450酶可以參與心衰的發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)，心衰病人的心臟中CYP2J2和CYP2E1表達均增多[6]。EETs在心肌疾病中具有重要的生理病理作用，如抗心肌缺血、抗炎癥反應、改善內(nèi)皮功能、抗血小板黏附與聚集等作用，從而起到心肌保護作用。能代謝花生四烯酸產(chǎn)生EETs的CYP亞家族主要是CYP2家族，主要是2C和2J，分布于血管內(nèi)皮和心肌細胞[8]。HETE是一種潛在的血管收縮劑，作為血管收縮劑的屬性與它所作用的離子通道相關(guān)聯(lián)，代謝花生四烯酸產(chǎn)生HETE的CYP亞家族主要是CYP4家族[9]。人參皂苷Re處理后能夠明顯上調(diào)CYP2C11和CYP2J3表達水平，與對照組相比，CYP2C11和CYP2J3 mRNA表達水平分別誘導至1.6和1.8倍；而人參皂苷Re對CYP4A1基因表達水平明顯下調(diào)作用。進一步在蛋白水平研究了人參皂苷Re對CYP表氧化酶和羥氧化酶的影響，人參皂苷Re可以上調(diào)CYP450表氧化酶的表達水平，下調(diào)CYP450羥氧化酶的表達水平。特別是對于CYP4A1，人參皂苷Re在基因和蛋白表達水平都有明顯的下調(diào)作用，而對CYP2J3在基因和蛋白表達水平都有明顯的上調(diào)作用。人參皂苷Re改變了CYP2J3和CYP4A1的基因和蛋白水平，這可能是人參皂苷Re對心肌細胞作用的新靶點。

研究發(fā)現(xiàn)，EETs能夠促進心肌細胞分泌內(nèi)源性物質(zhì)利鈉肽(atrial natriuretic peptide, ANP)，ANP通過鈉鹽調(diào)節(jié)體液平衡，降低后負荷，舒張血管，抑制心肌細胞肥大，減緩心室重構(gòu)，發(fā)揮著重要的代償作用[10]。對于ANP的檢測結(jié)果顯示，人參皂苷Re能夠明顯上調(diào)ANP基因表達水平。ANP對心臟有許多保護作用，如降低血壓、擴張血管，抑制心肌肥厚和抗纖維化、抵制氧化應激反應、保護缺血/再灌注損傷等重要的生物學作用等[11]。人參皂苷Re對ANP的作用還需要進一步確證。

人參皂苷Re是人參最主要的有效成分，具有確切的療效；其心肌保護作用也有初步研究，但發(fā)揮作用的分子機制并未得到真正的闡述。本研究將藥物代謝酶CYP450酶引入心肌細胞作用研究中，人參皂苷Re可以調(diào)節(jié)心臟表達CYP450酶之間的不平衡，繼而參與心臟發(fā)病機制HETE和EETs之間不平衡，從而產(chǎn)生心肌減毒作用。但現(xiàn)象背后的本質(zhì)，還需觀察人參皂苷Re對細胞損傷模型的作用，更要在動物水平進行藥效學實驗和作用機制研究。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

(致謝：本實驗在軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所藥理毒理研究室完成。)

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for 1, 5, 10, 50, 100 μmol·L-1or 6, 24, 36, 48, 60 h. CYP2C11, 2J3, 4A1, 4A3, 4F4 and ANP mRNA expressions were analyzed by Real time PCR, and CYP4A1, 2J3 protein expressions were detected by Western blot. ResultsCompared with control group, ginsenoside Re could effectively upregulate CYP2C11, CYP2J3, ANP mRNA expression to 1.6, 1.8, 3.2 fold, and downregulate CYP4A1, CYP4A3, CYP4F4 mRNA expression to 0.4, 0.15, 0.3 fold. Ginsenoside Re could decrease CYP4A1 protein expression in a concentration-dependent manner, while ginsenoside Re could increase CYP2J3 protein expression in a concentration-dependent manner.ConclusionGinsenoside could regulate CYP450 enzyme and change ANP gene expression, which might be the molecular mechanism of ginsenoside Re.

Effect of ginsenoside Re on cytochrome P450 in H9c2 cells

MA Zeng-chun1, XIAO Yong1, ZHAO Jiao-wei1,2, WANG Yu-guang1, TAN Hong-lin1,LIANG Qian-de1, TANG Xiang-lin1, XIAO Cheng-rong1, YANG Ling3, GAO Yue1

(1.BeijingInstituteofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China; 2.GraduateSchoolofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 3.HangzhouConvalescentHospital,Hangzhou310002,China)

Key words:ginsenoside Re; cardiac myocyte；atrial natriuretic peptide；cytochrome 450; cytochrome 2J3；cytochrome 4A1

Abstract:AimTo observe the cytochrome 450 effect of ginsenoside Re on H9c2 cells, in order to clarify the molecular mechanism of ginsenoside Re.MethodsH9c2 cells were separately treated with ginsenoside Re

收稿日期:2015-12-11,修回日期:2016-02-28

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(No 2012CB518402)；國家自然科學基金資助項目(No 81274127)；國家科技重大專項(No 2014ZX09J14104-01A)

作者簡介:馬增春(1970-)，男，博士，副研究員，研究方向：中藥藥理學，E-mail: mazchun@139.com; 高月(1963-)，女，博士，研究員，研究方向：中藥藥理學，通訊作者，E-mail: gaoyue@bmi.ac.cn; 楊凌(1970-)，女，副主任醫(yī)師，研究方向：中藥藥理學，通訊作者，E-mail: yangling817667@163.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.011

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0494-05

中國圖書分類號：R284.1；R322.11；R394.2；R345.99；R977.6

網(wǎng)絡出版時間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.022.html