李興安　牛慶生　薛運(yùn)波

（吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林132108）

西方蜜蜂的線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶亞基-I～細(xì)胞色素氧化酶亞基-II富含A＋T非編碼區(qū)單倍型類群

李興安牛慶生薛運(yùn)波

（吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林132108）

西方蜜蜂（Apis mellifera）的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）細(xì)胞色素氧化酶亞基-I（cytochrome C oxidase subunit I,COI）～細(xì)胞色素氧化酶亞基-II（COII）富含A+T非編碼區(qū)（AT-rich noncoding region，NC）屬于高變異DNA序列，既呈現(xiàn)mtDNA長(zhǎng)度變異又呈現(xiàn)mtDNA序列變異，它作為mtDNA多態(tài)性標(biāo)記廣泛地應(yīng)用于A.m.地理亞種的DraI酶限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，DraI RFLP）分析和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分析。在本文中，A.m.非洲世系mtDNA的28種DraI RFLP譜圖被歸納為3種COI-COII NC單倍型類群，即P0、Q元件組成類群，P1、Q元件組成類群以及P2、Q元件組成類群；A.m.西部歐洲世系mtDNA的90種DraI RFLP譜圖被歸納為1種COI-COII NC單倍型類群，即P、Q元件組成類群；A. m.東部歐洲世系mtDNA的25種SNP譜圖被歸納為1種COI-COII NC單倍型類群，即Q元件組成類群；A.m.亞洲世系mtDNA的29種DraI RFLP譜圖被歸納為3種COI-COII NC單倍型類群，即P0、Q元件組成類群，P0'、Q元件組成類群以及P1'、Q元件組成類群。本文綜述了這個(gè)研究進(jìn)展。

西方蜜蜂；細(xì)胞色素氧化酶亞基-I～細(xì)胞色素氧化酶亞基-II非編碼區(qū)；線粒體DNA單倍型類群

西方蜜蜂（Apis mellifera，A.m.）是兼具生態(tài)環(huán)境保護(hù)（例如，保持植物多樣性）、設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展（例如，介導(dǎo)農(nóng)作物授粉）以及商業(yè)性養(yǎng)蜂生產(chǎn)（例如，促進(jìn)蜂蜜后熟）等多重價(jià)值的一個(gè)蜜蜂屬物種［1-4］。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，A.m.起源于非洲或（和）西部亞洲或（和）中部亞洲，并且在沿歐洲大陸擴(kuò)展過(guò)程中自然分布于西部歐洲和東部歐洲［5，6］。昆蟲(chóng)形態(tài)變異分析（和昆蟲(chóng)系統(tǒng)地理學(xué)分析）將A.m.大致劃分為24～29個(gè)地理亞種，或演化譜系，或親緣譜系，或系統(tǒng)發(fā)育分支［7-9］。事實(shí)上，相對(duì)于其它顯花植物傳粉昆蟲(chóng)，A.m.具有低的種內(nèi)多樣性［10］；而且，A.m.種內(nèi)多樣性長(zhǎng)期遭受商業(yè)性蜜蜂繁育、蜜蜂轉(zhuǎn)地飼養(yǎng)、外來(lái)蜜蜂輸入乃至蜜蜂蜂群崩潰綜合征等諸多非自然選擇因素的影響［11］。因此，伴隨A.m.自然分布格局逐漸消失和A.m.種群數(shù)量不斷減少，A.m.種內(nèi)多樣性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)［9，12，13］。

蜜蜂保護(hù)研究的一個(gè)主要內(nèi)容是通過(guò)A.m.線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）單倍型分析獲得A. m.地理亞種的分子證據(jù)［14］。Cornuet等（1991）最初通過(guò)比較A.m.與黑腹果蠅近緣物種Drosophila yakuba的mtDNA同源區(qū)發(fā)現(xiàn)，A.m.的mtDNA細(xì)胞色素氧化酶亞基-I基因與CO亞基-II（COII）基因之間存在長(zhǎng)串聯(lián)重復(fù)DNA序列，并且將其命名為COI-COII基因間隔序列［15］。之后，Crozier等（1993）進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這段mtDNA特異序列尚存在1個(gè)亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（t-RNALeu）基因，t-RNALeu基因與COII基因之間的DNA序列如同mtDNA其它基因間隔序列，是富含A＋T（或T＋A）重復(fù)序列的非編碼區(qū)［16］。迄今為止，A.m.的mtDNA單倍型分析表明，NC是mtDNA在分子進(jìn)化過(guò)程中保留A.m.種內(nèi)多樣性“遺跡”的最豐富“印記”，它作為一種多態(tài)性mtDNA標(biāo)記已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于鑒定A.m.地理亞種［8］。大量文獻(xiàn)詳細(xì)報(bào)道了A.m.地理亞種的COI-COII單倍型，即A.m.地理亞種mtDNA多態(tài)性?？傮w上，A.m.地理亞種的COI-COII單倍型，既呈現(xiàn)mtDNA長(zhǎng)度多態(tài)性規(guī)律又呈現(xiàn)mtDNA序列多態(tài)性規(guī)律，前者被表征為一系列DraI酶限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性譜圖，后者被表征為一系列單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）譜圖。那么，這些研究成果意味著什么呢？

在非A.m.的mtDNA多態(tài)性相關(guān)文獻(xiàn)中，例如，甲殼綱（Crustacea）擊鉤蝦科（Talitridae）動(dòng)物mtDNA單倍型分析研究，NC序列被描述為COI-COII非編碼區(qū)（COI-COII NC）［17］。在此基礎(chǔ)之上，本文以COI-COII NC為mtDNA單倍型研究的技術(shù)指標(biāo)，進(jìn)一步將A.m.地理亞種歸納為不同的COI-COII單倍型類群。

1　A.m.的COI-NC-COII

A.m.的mtDNA全長(zhǎng)16,343堿基［16］。如同其他高等昆蟲(chóng)的mtDNA，A.m.的mtDNA由基因序列和基因間隔序列兩部分組成?；蛐蛄性趍tDNA全長(zhǎng)范圍內(nèi)占據(jù)多數(shù)序列坐位，為長(zhǎng)片段mtDNA,包括2個(gè)核糖體亞基基因、22個(gè)必需氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因和13個(gè)線粒體呼吸鏈組成型蛋白質(zhì)基因，在物種進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)不變；基因間隔序列在mtDNA全長(zhǎng)范圍內(nèi)占據(jù)少數(shù)序列坐位，為短片段mtDNA,包括1個(gè)mtDNA復(fù)制起始序列和多個(gè)NC，在物種進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)可變［16，18，19］。mtDNA復(fù)制起始序列具有相對(duì)短的序列長(zhǎng)度，呈現(xiàn)相對(duì)簡(jiǎn)單的序列組成，涵蓋相對(duì)少的遺傳信息；NC具有相對(duì)長(zhǎng)的序列長(zhǎng)度，呈現(xiàn)相對(duì)復(fù)雜的序列組成，涵蓋相對(duì)多的遺傳信息［15］。相對(duì)于A.m.的mtDNA其它NC，COI-COII NC是mtDNA高變異區(qū)［18］。

相對(duì)于黑腹果蠅近緣物種Drosophila yakuba的COI-COII NC序列長(zhǎng)度（僅幾個(gè)堿基），A.m.的COICOII NC序列長(zhǎng)度明顯地增長(zhǎng)（達(dá)幾百乃至上千個(gè)堿基）［15］。按照DNA由5'端至3'端延伸的合成方向，A.m.的COI-COII NC以其5'端承接于t-RNALeu基因序列3'端，以其組成型序列P和序列Q（分別被命名為P元件和Q元件）形成組織結(jié)構(gòu)單元，以其3'端與COII基因序列5'端相延續(xù)［20］。P元件全長(zhǎng)54個(gè)堿基，占據(jù)COI-COII NC的近5'端區(qū)段，具有相對(duì)均一的DNA序列組成；Q元件全長(zhǎng)194個(gè)堿基，占據(jù)COI-COII NC的近3'端區(qū)段，具有相對(duì)不均一的DNA序列組成﹙即它的近5'端序列長(zhǎng)度為48個(gè)堿基，是部分COI基因序列的同源片段，被命名為Q1序列；它的中間序列長(zhǎng)度為78個(gè)堿基，是全長(zhǎng)t-RNALeu基因序列的同源片段，被命名為Q2序列；它的近3'端序列全長(zhǎng)為70個(gè)堿基，是P元件的同源片段，被命名為Q3序列﹚［15］。在A.m.的COI-COII NC中，多個(gè)連續(xù)堿基缺失和（或）插入導(dǎo)致mtDNA的限制性核酸內(nèi)切酶DraI酶切位點(diǎn)移碼,COICOII NC由此成為DraI RFLP多態(tài)性分析獲得mtDNA單倍型數(shù)據(jù)的一個(gè)遺傳學(xué)基礎(chǔ)［21］；另一方面，單個(gè)不連續(xù)堿基缺失和（或）插入及替換導(dǎo)致mtDNA的緊密連鎖位點(diǎn)點(diǎn)突變，COI-COII NC由此成SNP多態(tài)性分析獲得mtDNA單倍型數(shù)據(jù)的另外一個(gè)遺傳學(xué)基礎(chǔ)［14，21-24］。

在A.m.地理亞種的COI-COII NC單倍型分析中，mtDNA長(zhǎng)度多態(tài)性既反映于P元件長(zhǎng)度變異又反映于Q元件長(zhǎng)度變異；mtDNA序列多態(tài)性僅反映于Q元件序列變異。對(duì)于P元件多態(tài)性，P元件缺失13個(gè)堿基時(shí)被命名為P0元件，缺失15個(gè)堿基時(shí)被命名為P1元件，缺失18個(gè)堿基時(shí)被命名為P2元件，全序列缺失意味著P元件從COI-COIINC“刪除”。對(duì)于Q元件多態(tài)性，Q元件2拷貝串聯(lián)重復(fù)被命名為QQ,3拷貝串聯(lián)重復(fù)被命名為QQQ，4拷貝串聯(lián)重復(fù)被命名為QQQQ，5拷貝串聯(lián)重復(fù)被命名為QQQQQ。

2　A.m.的COI-COII NC單倍型類群

非洲大陸及其近海島嶼是A.m.的自然分布區(qū)［5，8］。昆蟲(chóng)形態(tài)變異分析（和昆蟲(chóng)系統(tǒng)地理學(xué)分析），將分布于那里的非洲蜂等A.m.地理亞種（及其相關(guān)生態(tài)類型）概括為A.m.非洲世系［25］?；贒raI RFLP分析，本文將A.m.非洲世系樣本的28種DraI RFLP譜圖歸納為3種A.m.的COI-COII NC單倍型類群，即P0、Q元件組成類群，P1、Q元件組成類群以及P2、Q元件組成類群［21，26-31］。其中，P0、Q元件組成類群具有1個(gè)P0元件和4個(gè)不同串聯(lián)重復(fù)頻率Q元件，至少包括P0Q、P0QQ、P0QQQ以及P0QQQQ 4種mtDNA單倍型類型［21，26-28，31］；P1、Q元件組成類群具有1個(gè)P1元件和3個(gè)不同串聯(lián)重復(fù)頻率Q元件，至少包括P1Q、P1QQ以及P1QQQ 3種mtDNA單倍型類型［21］；P2、Q元件組成類群具有1個(gè)P2元件和2個(gè)相同串聯(lián)重復(fù)頻率Q元件，僅為P2QQ 1種mtDNA單倍型類型［21］。

（未完待續(xù)）

Cytochrome C oxidase subunit I（COI）-COII ingtergenic sequence AT-rich noncoding region haplotype groups of Apis mellifera species

Li Xing'an，Niu Qingsheng，Xue Yunbo
（Jilin Provincial Institute of Apicultural Science,Jilin 132108）

Cytochrome C oxidase subunit I（COI）-COII ingtergenic sequence AT-rich noncoding region（COI-COII NC）is specific for mtDNA of Apis mellifera（A.m.）.This region has considerable DNA variability in both length and sequence,for which it has been used extensively as a polymorphic marker of mtDNA for analyzing DraI RFLP and SNP among A.m.geographic subspecies.Here,mtDNA of A.m.lineage in Africa,which are characterized by 28 DraI RFLP patterns,is induced to be composed of 3 COI-COII NC haplotype groups of A.m.,i.e.the groups with both P and Q elements where P can also appear in two types of variations（P0and P1）；mtDNA of A.m.lineage in western Europe, which are characterized by 90 DraI RFLP patterns,is induced to be composed of 1 COI-COII NC haplotype group of A. m.,i.e.the group with both P and Q elements；mtDNA of A.m.lineage in eastern Europe,which are characterized by 25 SNP patterns,is induced to be composed of 1 COI-COII NC haplotype group of A.m.,i.e.the group only with Q element；mtDNA of A.m.lineage in western Asia,which are characterized by 29 DraI RFLP patterns,is induced to be composed of 3 COI-COII NC haplotype groups of A.m.,i.e.the groups with both P and Q elements where P can also appear in two types of variations（P0'and P1'）.We reviewed COI-COII NC haplotype groups of A.m..

Apis mellifera；Cytochrome C oxidase subunit I（COI）-COII ingtergenic sequence noncoding region；mtDNA haplotype groups

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130101094JC；20140101132JC）、國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-45-KXJ2；CA2S-45-SYZ4）

李興安（1965-），男，研究員，E-mail：Lxingan@sina.com