李 琦 姜大棟

（遼寧省大連市中山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116013）

REP、RAPD和PFGE方法在志賀菌分子分型中的應(yīng)用評(píng)價(jià)

李 琦 姜大棟

（遼寧省大連市中山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116013）

目的探討REP、RAPD和PFGE方法在志賀菌分子分型中的應(yīng)用效果。方法 以細(xì)菌基因組重復(fù)序列（REP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析（RAPD）、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE），分別對(duì)60株志賀菌分子進(jìn)行分型，并對(duì)3種方法加以評(píng)估。結(jié)果 REP、RAPD和PFGE的分子分型結(jié)果顯示，采用REP方法，有A、B兩型；采用RAPD方法，有A、B、C、D、E、F六型；采用PFGE方法，共有3個(gè)亞型，其中，51株可分為A、B、C、D、E五型，其余6株宋內(nèi)志賀菌為1單獨(dú)型。結(jié)論 在3種分子分型方法中，REP對(duì)高菌株分辨率差，在區(qū)域內(nèi)菌株分型方面，不具優(yōu)勢(shì)；RAPD分辨率高、分型精準(zhǔn)，但需花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間；PFGE明顯優(yōu)于前二者，分型效果更為細(xì)致，三者之間的差異性顯著，但PFGE操作更簡(jiǎn)便，用時(shí)更少，價(jià)格更低，而且對(duì)于細(xì)菌性痢疾暴發(fā)事件，有較好的病學(xué)調(diào)查效果。

REP；RAPD；PFGE；志賀菌分子；分型

伴隨分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了便于操作、分辨率高、易于推廣的分型技術(shù)；在病原菌分子分型方面，有許多方法，但目前還未形成集諸多優(yōu)點(diǎn)于一體的綜合性方法。當(dāng)前的PFGE分型技術(shù)屬于該領(lǐng)域的“金標(biāo)準(zhǔn)”，與REP、RAPD相比，優(yōu)勢(shì)更為明顯[1]。本組研究中，以細(xì)菌基因組重復(fù)序列（REP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析（RAPD）、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE），分別對(duì)60株志賀菌分子進(jìn)行分型，并對(duì)3種方法加以評(píng)估。現(xiàn)將具體情況報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：以REP、RAPD、PFGE，分別對(duì)60株志賀菌分子進(jìn)行分型。首先，準(zhǔn)備好儀器與試劑；本組實(shí)驗(yàn)中，選擇GeneLight 2004型PCR擴(kuò)增儀、JY300C型電泳儀、JY02S型紫外分析儀、脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀，選擇PFGE圖像分析軟件；系統(tǒng)有凝膠成像系統(tǒng)；本組實(shí)驗(yàn)中，選擇的試劑有瓊脂糖、TAE緩沖液、溴化乙錠、蛋白酶K、TaKaRa Tap kit、Marker DL2000、XbaI、Not Ⅰ限制性內(nèi)切酶、Seakem Gold低熔點(diǎn)瓊脂糖；選擇中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病的標(biāo)準(zhǔn)Marker H9812。

1.2 方法：首先，對(duì)DNA提??；對(duì)志賀菌單個(gè)菌進(jìn)行分離，并將其落傳種于M-H平板；其次，孵箱培養(yǎng)，溫度控制在35 ℃，以16 h為培養(yǎng)期；第三，對(duì)三環(huán)四環(huán)菌株進(jìn)行雙蒸水混合（100 μL），需將溫度控制在95 ℃，一般煮5 min即可，室溫離心以每分鐘12000轉(zhuǎn)為宜，30 s時(shí)間即可；DAN的提取，選擇上清即可；第四，運(yùn)用REP、RAPD、PFGE 3種方法進(jìn)行具體檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS19.0軟件操作系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料用（）表示，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

REP、RAPD和PFGE的分子分型結(jié)果顯示，采用REP方法，有A、B兩型；采用RAPD方法，有A、B、C、D、E、F六型；采用PFGE方法，共有3個(gè)亞型，其中，51株可分A、B、C、D、E五型，其余6株宋內(nèi)志賀菌為1單獨(dú)型。

3 討 論

本組研究中，采用REP、RAPD、PFGE，分別對(duì)60株志賀菌分子進(jìn)行分型；在REP檢測(cè)方面，以5’-GCGCCGLCATGCGGCATT-3’為單引物序列設(shè)計(jì)；在PCR體系中，選擇TapDNA聚合酶（5 U/μL）和緩沖液（Mg2+plus，選擇5 μL為宜），還有Dntp（4 μL）、25 mmol/L MgCl2（2 μL）、10 μmol引物（5 μL）、模板DNA（5 μL）、無(wú)菌雙蒸水（需補(bǔ)足，總反應(yīng)體積為50 μL）、液體石蠟（30 μL）；PCR擴(kuò)增條件選擇94 ℃（3 min）、94 ℃（1 min）、40 ℃（1 min）、65 ℃（2 min，30個(gè)循環(huán)）、65 ℃（10 min）；瓊脂糖凝膠電泳方面，對(duì)上面步驟所產(chǎn)生的物質(zhì)與loading bufer進(jìn)行混合，先取15 μL，再與10 ×loading bufer物進(jìn)行均勻混合，再加入含有1%的EB，置于瓊脂糖凝膠孔中，此時(shí)，需將DNA marker DL 2000同時(shí)加入；電壓100 V，電泳時(shí)間以3 h為宜，注意必須在紫外燈下進(jìn)行細(xì)致觀察，并對(duì)結(jié)果加以記錄；此檢測(cè)中，以肉眼觀察，并進(jìn)行Tenover標(biāo)準(zhǔn)判讀，作為判定標(biāo)準(zhǔn)[2]。

在RAPD檢測(cè)中，以5’-GCGCCGLCATGCGGCATT-3’為單引物序列設(shè)計(jì)；在PCR體系中，選擇TapDNA聚合酶（0.5 μL）、10*緩沖液（Mg2+plus，選擇5 μL為宜），還有10 mmol/L Dntp（4 μL）、25 mmol/L MgCl2（5 μL）、10 μmol引物（5 μL）、模板DNA（5 μL）、無(wú)菌雙蒸水（需補(bǔ)足，總反應(yīng)體積為50 μL）、液體石蠟（30 μL）；PCR擴(kuò)增條件選擇94 ℃（3 min）、94 ℃（30 s）、30 ℃（30 s）、72 ℃（60 s，30個(gè)循環(huán)）、65 ℃（5 min）；瓊脂糖凝膠電泳方面，對(duì)上面步驟所產(chǎn)生的物質(zhì)與loading buffer進(jìn)行混合，先取15 μL，再與10×loading buffer物進(jìn)行均勻混合，再加入含有1%的EB，置于瓊脂糖凝膠孔中。此時(shí)，需將DNA marker（100 bp Ladder）同時(shí)加入；電壓100 V，電泳時(shí)間以3 h為宜，注意必須在紫外燈下進(jìn)行細(xì)致觀察，并對(duì)結(jié)果加以記錄；此檢測(cè)中，可忽略條帶密度，若條帶數(shù)、位置相同，則歸于同一類型；通常的判定標(biāo)準(zhǔn)以條帶數(shù)目差≥2時(shí)，歸于異型[3]。

在PFGE檢測(cè)中，以“金標(biāo)準(zhǔn)”分析法為主，需使用限制性內(nèi)切酶Not Ⅰ（對(duì)福氏志賀菌）；對(duì)于宋內(nèi)志賀菌、標(biāo)準(zhǔn)株H9812，則需選擇限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ，按照指紋圖譜分析軟件進(jìn)行分析（BioNumerics software）。結(jié)果顯示，REP、RAPD和PFGE的分子分型結(jié)果顯示，采用REP方法，有A、B兩型；采用RAPD方法，有A、B、C、D、E、F六型；采用PFGE方法，共有3個(gè)亞型，其中，51株可分A、B、C、D、E五型，其余6株宋內(nèi)志賀菌為1單獨(dú)型。

綜上所述，REP對(duì)高菌株分辨率差，在區(qū)域內(nèi)菌株分型方面，不具優(yōu)勢(shì)；RAPD分辨率高、分型精準(zhǔn)，但需花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間；PFGE明顯優(yōu)于前二者，分型效果更為細(xì)致，三者之間的差異性顯著，但PFGE操作更簡(jiǎn)便，用時(shí)更少，價(jià)格更低，而且，對(duì)于細(xì)菌性痢疾暴發(fā)件，有較好的病學(xué)調(diào)查效果。

[1] 丁水軍.脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)及其在病原菌分子分型中的應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2012,12(53):110-111.

[2] 李雪,金莉莉,王秋雨.病原微生物分子分型技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2015,11(8):147-148.

[3] 孫永艷,申泉,李艷琴.腸桿菌基因間重復(fù)共有序列及應(yīng)用[J].生命的化學(xué),2014,13(6):10-11.

R378.2+5

B

1671-8194（2016）36-0021-02