劉思娣(LIU Si-di) 綜述，吳安華(WU An-hua) 審校

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙　410008)

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艱難梭菌毒力與芽孢研究進展

劉思娣(LIU Si-di) 綜述，吳安華(WU An-hua) 審校

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙410008)

[關(guān)鍵詞]艱難梭菌； 艱難梭菌感染； 毒力； 毒素； 芽孢

艱難梭菌(Clostridiumdifficile，CD)是梭菌屬中的一種專性厭氧、有芽孢、產(chǎn)毒素的革蘭陽性粗大桿菌，因其生長營養(yǎng)要求較高，分離培養(yǎng)困難，故得此名。一般棲生在人或動物腸道內(nèi)，通過糞-口途徑引起外源性感染，也可以在使用大量抗菌藥物后由腸道棲生的艱難梭菌引起內(nèi)源性感染。目前，艱難梭菌是唯一能引起醫(yī)院感染的厭氧菌，也是引起醫(yī)院感染病原體中唯一能形成芽孢的細菌。約25%的抗生素相關(guān)性腹瀉 (antibiotic-associated diarrhea，AAD)，75%的抗生素相關(guān)性腸炎(antibiotic-associated colitis，AAC)和近100%的假膜性腸炎(pseudomembranous colitis，PMC)均由此菌引起，統(tǒng)稱為艱難梭菌相關(guān)性疾病(Clostridiumdifficile-associated disease，CDAD)。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，艱難梭菌耐藥性增強，以及高致病菌株出現(xiàn)，導(dǎo)致CDAD發(fā)病率及致死率不斷增高。目前，國內(nèi)外已有諸多文獻詳細介紹了艱難梭菌生物學(xué)特性、實驗室檢測及耐藥機制，故本文就艱難梭菌毒力與芽孢予以簡要綜述。

1毒力

艱難梭菌可引起不同程度的腸道炎癥，包括無癥狀的艱難梭菌攜帶者，輕度、中度、重度腹瀉，甚至假膜性腸炎，嚴重者可致死[1]。艱難梭菌可感染不同年齡階段的人群，≥65歲的老齡人感染率最高，嬰幼兒感染率最低，大部分嬰幼兒存在艱難梭菌腸道定植，但無感染癥狀，可能是嬰幼兒本身缺少艱難梭菌毒素結(jié)合受體[2-3]。艱難梭菌繁殖體離開腸道通常24 h之內(nèi)死亡，而艱難梭菌芽孢能長時間生存在有氧環(huán)境中，經(jīng)過胃時不被胃酸殺死，進而在腸道產(chǎn)生毒素引起疾病。

細菌對宿主感染致病的能力稱為致病性，致病性的強弱與毒力有關(guān)。構(gòu)成毒力的物質(zhì)基礎(chǔ)主要包括侵襲力和毒素。細菌的侵襲力包括黏附、定植和產(chǎn)生侵襲性相關(guān)物質(zhì)的能力。艱難梭菌的侵襲力主要包括黏附素、生物被膜、菌毛與侵襲性酶等。艱難梭菌致病主要通過毒素介導(dǎo)，主要致病因子為毒素A(TcdA)及毒素B(TcdB)，此外還產(chǎn)生一種二元毒素[4]。之前人們認為艱難梭菌的毒力只由毒素決定，但隨著艱難梭菌致死率的增高及高毒素菌株的暴發(fā)，促進了人們對其他毒力成分的研究[5]。

1.1毒素毒素是艱難梭菌產(chǎn)生毒力的主要因素，也是引起艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection，CDI)的主要致病因子。艱難梭菌主要產(chǎn)生TcdA和TcdB兩種毒素，都是單糖基轉(zhuǎn)移酶，分別由tcdA和tcdB基因編碼。TcdA能引起兔腸襻黏膜分泌增多和出血，故又稱為腸毒素，分子質(zhì)量為308 kDa，對白細胞有趨化作用,可以與腸黏膜刷狀緣細胞上毒素受體結(jié)合，改變細胞肌動蛋白骨架，介導(dǎo)黏膜上皮細胞的cAMP系統(tǒng)，使水和鈉分泌增加，導(dǎo)致分泌性腹瀉，致使腸壁出現(xiàn)炎癥、滲出、甚至黏膜出血壞死，也有一定的細胞毒性作用，但毒力小于TcdB。TcdB為細胞毒素，分子質(zhì)量為269 kDa，可刺激單核細胞釋放炎性因子，直接破壞腸壁細胞，引起炎性反應(yīng)而引發(fā)腸黏膜細胞凋亡、變性、壞死和脫落，甚至形成假膜性炎癥。既往一般認為，TcdA為腸毒素，引起腹瀉和腸炎；TcdB僅在TcdA損傷腸黏膜細胞基礎(chǔ)上致病。但近十年來，臨床上出現(xiàn)由于tcdA基因缺失導(dǎo)致只產(chǎn)TcdB不產(chǎn)TcdA(A-B+型)艱難梭菌菌株感染的暴發(fā)性流行。尤其在韓國，A-B+型 CDI發(fā)病率從1995年的4.2%上升至2008年的25.7%。A-B+型艱難梭菌最初認為是無致病性，而如今認為A-B+可導(dǎo)致假膜性腸炎，嚴重者致死，TcdB無需TcdA的預(yù)先作用可以直接致病，引起腸道局部性炎癥。目前認為兩種毒素的作用是協(xié)同的，先由TcdA引起腸黏膜損傷，破壞細胞間的緊密連接，并激活上皮細胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致cAMP增加而引起鈉分泌增多；在TcdA作用的基礎(chǔ)上，TcdB發(fā)揮細胞毒作用，增加上皮細胞的通透性，引起腸液和電解質(zhì)分泌增加，嚴重者壞死、脫落的細胞與滲出的纖維素，以及炎性細胞等形成假膜。

艱難梭菌除可以產(chǎn)生TcdA和TcdB，還能產(chǎn)生一種更強毒素，即為二元毒素。二元毒素是一種腺苷二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，在真核細胞中修飾肌動蛋白，導(dǎo)致細胞骨架破環(huán)，其編碼基因由負責(zé)編碼具有酶活性毒素的cdtA和編碼受體結(jié)合的cdtB兩部分組成[6]。許多產(chǎn)毒株中二元毒素均不表達[7]，而高毒力027和078艱難梭菌通常均表達二元毒素[8]，典型代表菌株為BI/NAP1/027(PCR核糖體分型為027，脈沖場凝膠電泳分型為NAP1，限制性內(nèi)切酶分型為BI)。近年來，027艱難梭菌菌株的全球流行導(dǎo)致CDI發(fā)病率快速增長，其可引起嚴重腹瀉，高致死率，高復(fù)發(fā)率以及對喹諾酮高耐藥率。相關(guān)研究[9]對流行的BI/NAP1/027菌株cdt基因座進行分析，發(fā)現(xiàn)cdt具有增加TcdA和TcdB毒性的作用。Warny等[10]體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，高毒力RT027 TcdA、TcdB產(chǎn)量的高峰中位值分別是其他核糖體型的16、23倍。艱難梭菌的二元毒素能產(chǎn)生腸毒性作用，并且在CDI中有潛在輔助作用[11]。

致病決定區(qū)(pathogenicity locus，PaLoc)是艱難梭菌致病菌染色體片段的一部分，艱難梭菌致病決定區(qū)除毒力編碼基因(tcdA和tcdB基因)外，還有毒力調(diào)控基因，包括負向調(diào)節(jié)基因tcdC、正向調(diào)節(jié)基因tcdR及膜孔蛋白基因tcdE。以上基因共同構(gòu)成了一個大小為19.6 kb的致病決定區(qū)。tcdC是一個具有26個堿基的膜相關(guān)蛋白，tcdC有反σ因子的作用， 可以阻止tcdR與核心RNA合酶的結(jié)合[12]，從轉(zhuǎn)錄水平抑制毒素基因的表達，是毒素表達的負向調(diào)節(jié)因子。tcdC基因的部分堿基缺失，基因序列發(fā)生突變，負調(diào)節(jié)機制受損，可導(dǎo)致TcdA和TcdB產(chǎn)量急劇增加，進而使艱難梭菌致病性增強。高毒力RT027毒力調(diào)節(jié)基因tcdC上有一段18個核苷酸區(qū)域的缺失，且117位出現(xiàn)一個單核苷酸的缺失，從而出現(xiàn)移碼突變，使得tcdC的負調(diào)節(jié)作用大大減弱，從而使TcdA和TcdB的產(chǎn)量增高[13]；另一高毒力型RT078，tcdC上有一段39個核苷酸區(qū)域(從341位到379位)的缺失，且184位出現(xiàn)一個單核苷酸的突變(C184T)，從而導(dǎo)致產(chǎn)生終止密碼子[8]。tcdR編碼正性調(diào)控因子tcdR，tcdR為蛋白質(zhì)，為σ因子(轉(zhuǎn)錄起始因子) 家族的一部分，可以結(jié)合RNA聚合酶全酶促進基因tcdR、tcdA、tcdB的表達[14]；tcdE基因編碼一種類似穿孔素的蛋白質(zhì)，這種物質(zhì)能夠促進TcdA和TcdB的釋放。在艱難梭菌動力學(xué)對數(shù)生長期tcdC基因的表達增強，而tcdA、tcdB、tcdD、tcdE的表達減弱，而在穩(wěn)定期則相反[6, 8, 15-16]。

因艱難梭菌PaLoc位置的不同，可將艱難梭菌分為31種毒素型細菌，通過檢測PaLoc序列的變化可確定艱難梭菌毒素型。艱難梭菌毒素型研究[17]分析顯示，78%～88%艱難梭菌為毒素型0，2%～3%為毒素型Ⅲ，核糖核酸型027是毒素型Ⅲ中的一種。因艱難梭菌產(chǎn)的不同毒素，可將其分為4種類型：A-B-(tcdA-tcdB-)、A-B+(tcdA-tcdB+)、A+B+(tcdA+tcdB+)、A+B+二元毒素(tcdA+tcdB+cdtA+cdtB+)。A-B-型艱難梭菌不產(chǎn)毒素，無致病性，一般存在于無癥狀CDI的成年人和嬰兒中。A-B+型艱難梭菌tcdA3′末端一般有1.8 kb的基因缺失，有些甚至有6kb的基因缺失，因PaLoc區(qū)域tcdA基因存在不同程度的缺失，所以要短很多，A-B+型艱難梭菌只產(chǎn)tcdB，但仍可引起假膜性腸炎，最典型的為核糖核酸型的017。A+B+型艱難梭菌的PaLoc區(qū)域是一個19.6 kb的編碼區(qū)域。A+B+二元毒素典型代表是2003年英國首次暴發(fā)的027高毒素和2008年暴發(fā)的078高毒素。目前，尚未檢出A+B-型艱難梭菌。

1.2侵襲力

1.2.1黏附素艱難梭菌定植是引起感染的首要條件。研究[1]表明，艱難梭菌表面蛋白與腸組織相互作用，使艱難梭菌黏附于腸道壁，進而引起CDI，所以艱難梭菌表面蛋白是引起定植的重要原因之一。有學(xué)者認為，膠原蛋白結(jié)合蛋白A(collagen binding protein A，CbpA)是表達于艱難梭菌表面上的一種重要的細胞表面結(jié)合蛋白，在艱難梭菌定植過程中發(fā)揮重要作用。CbpA是識別黏連基質(zhì)分子的微生物表面成分(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecule,MSCRAMM)家族中的新成員之一。實驗表明，CbpA攜帶LPXTG細胞壁錨定結(jié)構(gòu)區(qū)域，以高親和力結(jié)合人類膠原蛋白I和V，可促進艱難梭菌結(jié)合到人類腸道壁上。Hennequin等[18]2001年研究發(fā)現(xiàn)，GroEL是指熱休克蛋白60,其具有細胞黏附作用，GroEL在熱休克后細胞外釋放。GroEL的特異性抗體、純化該蛋白、細胞接觸誘導(dǎo)等實驗方法均證明了艱難梭菌GroEL的黏附作用。該作者在2003年研究中還發(fā)現(xiàn)Fbp68可能是艱難梭菌黏附素之一[19]，F(xiàn)bp68是一種可結(jié)合纖維連接蛋白、68 kDa大小的細胞表面結(jié)合蛋白，可促進艱難梭菌與腸道中纖維基質(zhì)連接、定植；免疫印跡法、間接免疫熒光法、ELISA 3種方法均表明艱難梭菌可結(jié)合纖維連接蛋白。CDI期艱難梭菌表面上的高分子及低分子的表面層蛋白(SLPS)有黏附宿主細胞能力[20-21]；細胞壁蛋白CWP66和CWP84均具有黏附及可降解細胞外基質(zhì)的作用[22-23]。

抑制艱難梭菌的黏附是控制感染的有效手段。鞭毛黏附作用可使細菌致病性增強[24]。Baban等[25]研究認為，鞭毛運動性可促進艱難梭菌黏附于腸道，鞭毛本身的結(jié)構(gòu)也可促進黏附，并且鞭毛結(jié)構(gòu)本身才是艱難梭菌黏附的重要因素。目前研究顯示，鞭毛蛋白FliC，鞭毛帽蛋白FliD是鞭毛中重要的黏附蛋白。Tasteyre等[26]體外實驗證明，F(xiàn)liC、FliD能黏附在無菌小鼠盲腸黏膜。Dingle等[27]采用誘導(dǎo)突變菌株的方法證明了FliD的黏附功能，認為FliD在不同艱難梭菌菌株中的黏附能力不同，使細菌的毒力發(fā)生了變化。

1.2.2生物被膜艱難梭菌能在腸道不利環(huán)境中生長，除芽孢以外，生物被膜可能是另一重要原因。一些致病菌反復(fù)感染與該致病菌形成微生物群落/生物膜的能力有關(guān)。艱難梭菌生物被膜的形成是一個復(fù)雜、多因素參與的過程。艱難梭菌形成生物被膜后受到保護，可以抵御高濃度的萬古霉素。研究[28]認為，spoA不僅是一種產(chǎn)芽孢調(diào)節(jié)因子，也參與生物被膜的形成，但spoA參與生物被膜形成的機制尚不明確，有待于進一步研究。

1.2.3菌毛菌毛與宿主細胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合而黏附、定居于黏膜表面，有助于細菌侵入，與細菌的侵襲力密切相關(guān)。IV型菌毛(T4Ps)具有黏附、定植、DNA轉(zhuǎn)移等作用[29]；T4Ps也可促進艱難梭菌聚集，作用機制可能與單磷酸鳥苷環(huán)二聚體(C-di-GMP)作為核糖開關(guān)調(diào)控有關(guān)。Bordeleau 等[30]使T4Ps兩個基因(pliA1 CD3513和pliB1 CD3512)失活，結(jié)果導(dǎo)致菌毛結(jié)構(gòu)形成受阻，減少了艱難梭菌的聚集。

1.2.4侵襲性酶侵襲性酶與細菌毒力相關(guān)，如透明質(zhì)酸酶能水解動物機體內(nèi)的透明質(zhì)酸，使機體對異物的通透性增強，致病微生物能在組織中隨意活動，進而促進其在組織中擴散蔓延。艱難梭菌擁有多種侵襲性酶，包括透明質(zhì)酸酶、軟骨素-4-硫酸醋酶、 膠原酶和蛋白酶等，尤其是強毒菌株，皆有透明質(zhì)酸酶、軟骨素-4-硫酸醋酶和膠原酶。但目前尚不清楚艱難梭菌毒力與侵襲性酶之間的關(guān)系，有可能是上述侵襲性酶釋放了一些基本的必需營養(yǎng)物，從而促進了艱難梭菌在腸道的定植[31]。

2芽孢

艱難梭菌為嚴格的專性厭氧菌，不能長時間在有氧環(huán)境中存活[32]，而芽孢具有非常強的抵抗力，在宿主體外的有氧環(huán)境中可存活數(shù)周至數(shù)月[33]。芽孢耐熱，100℃ 1 h才能死亡，耐干燥、耐強酸強堿，對抗菌藥物高度耐藥，甚至對某些抗菌藥物固有耐藥[34]；一旦污染環(huán)境，醫(yī)院中許多消毒劑 (如常用的無漂白消毒劑)也不能將其殺死[35]，是CDI及傳播的主要原因，也是引起CDI疾病難治性及復(fù)發(fā)的重要原因。艱難梭菌芽孢通過糞-口途徑進入易感人群消化道，在腸道中出芽，形成艱難梭菌菌株，進而可發(fā)展為CDI。艱難梭菌芽孢的總體結(jié)構(gòu)與其他內(nèi)生孢子類似，但最外層結(jié)構(gòu)稍有不同，艱難梭菌最外層結(jié)構(gòu)為芽孢外殼和外壁，目前其發(fā)病機制還不明確。感染期間艱難梭菌可進一步誘發(fā)芽孢形成通路，產(chǎn)生更多的芽孢。

芽孢出芽是CDI最重要的一步。當(dāng)特定出芽受體(specific germinant receptors，SGRs)感受到特異小分子物質(zhì)時，芽孢出芽。特異小分子包括核苷、糖類、氨基酸，以及一些離子[36]，尤其是特定的膽酸鹽及其衍生物(牛黃膽酸鹽、甘膽酸鹽、脫氧膽酸鹽)。特定出芽受體與L-甘氨酸結(jié)合作為出芽開始的第一步[37-38]。

許多桿菌及梭菌屬芽孢的形成是由幾種孤立組氨酸激酶決定的，能使主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子spoA磷酸化[39-40]。艱難梭菌菌株630基因編碼5種孤立組氨酸激酶(CD1352、CD1492、CD1579、CD1949和CD2492)，CD2492失活可降低芽孢形成率，spoA突變則完全阻斷芽孢的形成[41]。

近年來，隨著抗菌藥物廣泛應(yīng)用，艱難梭菌感染率及致死率日益上升，已成為全世界關(guān)注的問題。雖然國內(nèi)外對艱難梭菌的研究已有幾十年，但隨著艱難梭菌高耐藥菌株及強毒力菌株的出現(xiàn)，艱難梭菌感染復(fù)發(fā)率及致死率增高，給艱難梭菌的診斷、預(yù)防及治療帶來了許多新的問題。因此，建議繼續(xù)加強對艱難梭菌的基礎(chǔ)及臨床研究，及時開發(fā)艱難梭菌檢測方法，為艱難梭菌的防治提供幫助。

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(本文編輯：左雙燕)

Research advance in virulence and spore ofClostridiumdifficile

(Xiangya Hospital,Central South University, Changsha 410008, China)

[收稿日期]2016-03-08

[基金項目]中南大學(xué)湘雅醫(yī)院青年基金項目(2014Q05)

[作者簡介]劉思娣(1989-)，女(漢族)，湖南省永州市人，碩士研究生，主要從事感染性疾病研究。 [通信作者]吳安華E-mail：dr_wuanhua@sina.com

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2016.06.020

[中圖分類號]R378.8

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-9638(2016)06-0436-05

·綜述·