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JAK2 V617F基因突變與腦梗死的相關(guān)性

周水陽(yáng)胡喜梅趙迎春1包維鶯李旗1柯金陸翠范燕琴朱銳鋒王恒石劉媛張文慧

(上海市松江區(qū)中心醫(yī)院血液科,上海201600)

關(guān)鍵詞〔〕腦梗死；JAK2V617F突變；等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(AS-PCR)

1上海市松江區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

第一作者：周水陽(yáng)(1971-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事血液腫瘤研究。

腦梗死占急性腦梗死的 20%～30%〔1,2〕。JAK2 V617F 基因突變?yōu)轶w細(xì)胞獲得性單核苷酸突變，是由 JAK2 基因1 849 位鳥(niǎo)嘌呤(G)突變?yōu)樾叵汆奏?T)，使 JAK2 蛋白 617 位纈氨酸錯(cuò)義編碼為苯丙氨酸，導(dǎo)致 JH2 區(qū)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其對(duì)JH1區(qū)的抑制作用消失、JAK2激酶的活性增加〔3〕。JAK2 V617F 基因突變可出現(xiàn)在非典型慢性粒細(xì)胞性白血病、慢性粒單細(xì)胞性白血病、慢性中性粒細(xì)胞性白血病、特發(fā)性嗜酸細(xì)胞增多癥、骨髓增生異常綜合征(MDS)中〔4,5〕，本研究旨在了解JAK2 V617F基因突變與腦梗死相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料2012年1月至2013年1月我院神經(jīng)內(nèi)科收治的影像學(xué)(CT)或磁共振成像(MRI)明確的腦卒中和腔隙性腦梗死患者60例不合并常見(jiàn)腦梗死患者的外周血，即患者均不合并高血壓、糖尿病、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病且不伴有血小板、血紅蛋白升高。男36例，女24例，年齡47～71周歲。30例我院健康體檢健康者的外周血為健康對(duì)照。男17例，女13例，年齡47～71周歲。

1.2基因組DNA提取采集患者外周血2 ml，用Invitek DNA試劑盒提取基因組DNA，用分光光度計(jì)(型號(hào)PICO17)檢測(cè)濃度并確定純度后，DNA終濃度調(diào)整為50 ng/μl。

1.3JAK2/V617F 突變檢測(cè)采用等位基因特異性 PCR(AS-PCR)方法檢測(cè) JAK2 基因第 12 號(hào)外顯子(1 849位 G→T 突變)，以包含 JAK2 基因 V617 密碼子位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，引物由 Invitrogen 公司合成。引物序列如下：P1:5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′；P2:5′-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3′；P3:5′-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGT-TTCA-3′。P1 和P2 擴(kuò)增長(zhǎng)度為203 bp,為陽(yáng)性序列；P2和P3擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為364 bp,為參考序列。反應(yīng)總體系25 μl：50 ng/μl模板 DNA 1 μl，10 pmol/μl引物各0.5 μl,10×HS Taq緩沖液2.5 μl，dNTPs(每種堿基終濃度2.5 mmol/L)2 μl,HS Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl(Takara公司產(chǎn)品)，去離子水17.3 μl。反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 5 min；94℃ 變性30 s，52℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。

1.4基因測(cè)序選取其中 20 例標(biāo)本送 Invitrogen 公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與 NCBI人類基因組資料庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，出現(xiàn) G→T 突變者為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和Kaplan-Meier 法回歸分析。

2結(jié)果

2.1JAK2 V617F點(diǎn)突變60 例腦梗死的患者經(jīng) AS-PCR 檢測(cè)到JAK2 V617F 點(diǎn)突變16例(26.7%)。圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳圖，JAK2 V617F 點(diǎn)突變陰性為364 bp一條帶，JAK2 V617F 點(diǎn)突變陽(yáng)性為203、364 bp兩條帶。而健康對(duì)照者只有364 bp一條條帶。將瓊脂糖凝膠電泳存在雙條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBⅠ人類基因庫(kù)對(duì)比，證實(shí)存在DNA突變，突變點(diǎn)位于JAK第12號(hào)外顯子，編碼V617的第一個(gè)堿基G被T替換，氨基酸由V變成F，即V617F。隨機(jī)取瓊脂糖凝膠電泳只有單條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物基因測(cè)序，均無(wú)突變。

2.2JAK2 V617F 突變型患者外周血細(xì)胞數(shù)分析由表1可看出這些 JAK2 V617F 突變型患者并不伴有血小板、血紅細(xì)胞的升高。

M：Marker；1：陽(yáng)性對(duì)照(HEL細(xì)胞系)；2：JAK2 V617F突變型患者；3：健康對(duì)照者圖1　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳圖

JAK2突變n血小板(×109/L)血紅蛋白(g/L)陰性44203.1±43.20169.25±13.25陽(yáng)性16210.3±55.41161.44±20.10P值0.110.14

3討論

James 等〔3〕率先報(bào)道在真紅細(xì)胞增多癥中發(fā)現(xiàn)了JAK2 基因突變(V617F)，隨著研究的深入，許多學(xué)者相信對(duì) JAK2V617F 的研究意義重大〔6，7〕。JAK2 蛋白分子是許多細(xì)胞因子在細(xì)胞膜內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的亞單位，其不但接受受體配體結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)，而且通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)更多蛋白質(zhì)分子的相互作用，改變它們的磷酸化狀態(tài)，以傳遞或放大信號(hào)。最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)分子是信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化亞單位(STATS)，活化的 JAK2 分子使 STATS 磷酸化而發(fā)生構(gòu)型改變，產(chǎn)生二聚體轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，改變靶基因的表達(dá)，因此，JAK-STAT 通路在細(xì)胞的增殖與抗凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。但是在上述配體、受體和 JAK2 聚集成異多聚體的過(guò)程中，任何一步的異常和畸變都足以消除激酶的活性，以致完全破壞整個(gè)信號(hào)通路，使細(xì)胞失去對(duì)細(xì)胞因子的正常反應(yīng)性,從而引發(fā)疾病的發(fā)生〔8〕。

由本研究結(jié)果推測(cè) JAK2 V617F 突變?cè)诓缓喜⒛X梗死有一定的高突變率，這為腦梗死發(fā)病機(jī)制探討提供了一定的參考價(jià)值，因此可作為腦梗死的易患因素加以考慮預(yù)防。

參考文獻(xiàn)4

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〔2014-05-17修回〕

(編輯杜娟)

基金項(xiàng)目：上海市松江區(qū)科學(xué)技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目(QK1107)

中圖分類號(hào)〔〕R4〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-7221-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.121