王瑋瑤　沈　楠　張以忠　鄭中華　金　宏　劉　威　齊　玲　于洪泉

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林　吉林　132013)

?

環(huán)磷酰胺對膠質(zhì)瘤體內(nèi)生長的影響

王瑋瑤沈楠張以忠鄭中華金宏劉威齊玲于洪泉1

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林吉林132013)

摘要〔〕目的探討環(huán)磷酰胺(CTX)對膠質(zhì)瘤體內(nèi)生長的影響及其機制。方法建立Wistar大鼠膠質(zhì)瘤模型，將其分為對照組(生理鹽水腹腔注射)和給藥組(CTX腹腔注射25 mg/kg)，觀察大鼠一般狀態(tài)、體重的變化，檢測腫瘤體積和重量變化，計算抑瘤率。Western印跡檢測腫瘤組織中細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1蛋白的表達(dá)。結(jié)果給藥組大鼠的一般狀態(tài)較好，大鼠體重恢復(fù)；給藥組腫瘤的體積縮小、重量降低，給藥10 d時與對照組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，計算其體積抑瘤率為38.59%。Western印跡顯示，給藥組表達(dá)cyclin D1蛋白減少，與對照組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CTX通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白cyclin D1來抑制膠質(zhì)瘤的體內(nèi)生長。

關(guān)鍵詞〔〕環(huán)磷酰胺；膠質(zhì)瘤；生長；cyclinD1

1吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科

于洪泉(1974-)，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腦腫瘤研究。

第一作者：王瑋瑤(1986-)，女，碩士，主要從事腦腫瘤藥物研究。

在全身腫瘤中腦腫瘤發(fā)病率雖然很低，但是以惡性為主，惡性腦腫瘤中又以膠質(zhì)瘤最為常見，并且由于位于顱內(nèi)，對患者健康和生命的影響極大。臨床上常用手術(shù)聯(lián)合放化療等多種治療方法，但療效差〔1，2〕。環(huán)磷酰胺(CTX)是臨床上常用的化療藥物之一，但其對膠質(zhì)瘤的單獨作用還未見相關(guān)報道。本實驗研究CTX對膠質(zhì)瘤體內(nèi)生長的影響，并初步探討其可能的作用機制。

1材料與方法

1.1藥品CTX(美國Sigma公司)。Bradford蛋白濃度測定試劑盒(美國Pierce公司)；β-actin和細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1抗體(美國Santa Cruz公司)。J-26XP超低溫高速離心機(美國貝克曼公司)；DNA蛋白電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Image-Pro Plus 圖像分析管理系統(tǒng)(Media Cybernetics公司)。

1.2動物雄性Wistar大鼠20只，購自吉林大學(xué)實驗動物中心〔動物合格證號SCXK(吉)2008-0005〕，體重220～240 g。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及接種大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，由吉林醫(yī)藥學(xué)院中心實驗室提供，置于含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度2×108/ml，臺盼藍(lán)染色檢測活細(xì)胞數(shù)超過95%，收集細(xì)胞后將其置于冰上。

1.4動物分組及造?！?〕將實驗大鼠隨機分為兩組，每組10只。于右股皮下接種100 μl含2×106個細(xì)胞的混懸液。術(shù)后觀察大鼠腫瘤生長情況及一般狀態(tài)。術(shù)后第3天，腹腔注射給藥，連續(xù)處理10 d。操作均在每日的下午同一時間進(jìn)行。

1.5Wistar大鼠體重變化測量不同時期兩組大鼠的體重，計算各個階段大鼠體重的平均值。

1.6測算腫瘤重量和體積抑瘤率〔4〕給藥后的第10天處死大鼠，取出完整的腫瘤組織，檢測腫瘤的重量及大小，計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=(對照組腫瘤平均體積-實驗組腫瘤平均體積)/對照組腫瘤平均體積×100%。測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤的體積。腫瘤體積=短徑2×長徑/2。

1.7Western印跡檢測cyclin D1蛋白PBS洗滌細(xì)胞，50 μl細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，4℃ 離心15 min，取上清測定樣品蛋白濃度，SDS-PAGE膠分離樣品，轉(zhuǎn)膜封閉，加入β-actin、cyclin D1抗體，4℃孵育過夜。二抗室溫孵育1 h，膠片曝光拍照。采用Image-Pro Plus圖像分析管理系統(tǒng)分析，以特異性條帶平均吸光度與面積的乘積，反映蛋白表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SSPS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗。

2結(jié)果

2.1大鼠的一般狀態(tài)造模前大鼠進(jìn)食均正常，身上毛發(fā)光澤柔順，活潑好動。造模后3 d大多數(shù)大鼠均可觸及腫瘤。給藥3 d時大鼠進(jìn)食減少，行動開始遲緩，毛發(fā)光澤度差。給藥7 d時對照組大鼠消瘦，脫毛加重，甚至出現(xiàn)顫抖；給藥組大鼠進(jìn)食開始增加，脫毛現(xiàn)象減輕，一般狀態(tài)好轉(zhuǎn)。給藥10 d時，對照組大鼠狀態(tài)極差；而給藥組大鼠已逐漸恢復(fù)正常。

2.2CTX對膠質(zhì)瘤大鼠體重的影響造模前、給藥當(dāng)天和給藥3 d時兩組大鼠體重相近；給藥7、10 d時，對照組大鼠體重逐漸減輕，而給藥組大鼠體重開始恢復(fù)；與對照組比較，給藥10 d時給藥組大鼠體重明顯增加(P>0.05)。見表1。

2.3CTX對大鼠膠質(zhì)瘤體積與重量的影響給藥組腫瘤體積減小〔(33.33±18.63)mm3〕、腫瘤重量減輕〔(2.00±2.23)mg〕，與對照組比較〔(54.27±46.43)mm3,(11.20±11.58)mg〕有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其體積抑瘤率為38.59%。

2.4CTX對腫瘤組織cyclin D1表達(dá)的影響與對照組(6.53±0.87)比較，給藥組cyclin D1蛋白(3.03±1.10)明顯降低(P<0.05)。

時間對照組給藥組造模前1d225.25±18.58229.83±13.78給藥當(dāng)天230.90±19.47238.11±14.01給藥3d230.44±23.42232.21±14.79給藥7d217.31±24.32225.17±13.09給藥10d215.98±27.53228.23±14.761)

與對照組比較：1)P<0.05

3討論

CTX是細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥物，單獨作用時并無抗腫瘤活性，當(dāng)進(jìn)入體內(nèi)后，會在肝臟內(nèi)經(jīng)氧化作用轉(zhuǎn)化成一過性的醛磷酰胺〔5〕，而后繼續(xù)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)再分解成有毒性作用的酰胺氮芥及丙烯醛。作為烷化劑類抗腫瘤藥物CTX可以干擾腫瘤細(xì)胞的DNA及RNA功能，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長，最終達(dá)到抗腫瘤的作用〔6〕。本研究說明，CTX可以抑制惡性膠質(zhì)瘤的體內(nèi)生長，并且可以改善機體的一般狀態(tài)。

CTX發(fā)揮作用時主要作用于細(xì)胞周期的S期，發(fā)揮細(xì)胞調(diào)控作用。細(xì)胞的生長受cyclins和cyclin依賴性激酶抑制因子的調(diào)控，其中cyclin D1對細(xì)胞的生長起到正向調(diào)節(jié)的作用，并且主要作用于S期。在多種惡性腫瘤組織中均有cyclin D1蛋白表達(dá)增加，說明其過度表達(dá)是多種人類原發(fā)性腫瘤的特征，對腫瘤的診斷和預(yù)后判斷具有重要意義〔7，8〕。本實驗結(jié)果說明，CTX可以通過抑制周期蛋白cyclin D1起到抑制腫瘤生長的作用，但更多的機制還需要進(jìn)一步驗證。

參考文獻(xiàn)4

1齊玲，金宏，趙東海，等.五味子木脂素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤神經(jīng)球細(xì)胞凋亡的機制研究〔J〕.中國藥學(xué)雜志，2014；49(2)：113-6.

2鐘越，齊玲，沈楠，等.越桔原花青素調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的機制研究〔J〕.中國病理生理雜志，2014；30(4)：603-8.

3王曉剛，魏學(xué)忠，周定標(biāo).Wistar 大鼠C6膠質(zhì)瘤動物模型的腫瘤生長特點〔J〕.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報，2001；22(4)：300-2.

4金岳雷，范曉艷，呂冬霞，等.五味子乙素對H22荷瘤小鼠抑制作用的病理學(xué)研究〔J〕.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2008；31(5)：7-8.

5王冠，黃楹，馮珂珂，等.AV-AS 聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療大鼠皮下膠質(zhì)瘤效果觀察〔J〕.山東醫(yī)藥，2011；51(2)：10-2.

6問明，馬振峰，張卓奇，等.環(huán)磷酰胺對腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)作用的研究〔J〕.河北醫(yī)藥，2014；36(13)：1942-5.

7Rekhi B，Motghare P.Cyclin D1 and p16INK4 positive endometrial stromal sarcoma：a case report with new insights〔J〕.Indian J Pathol Microbiol，2014；57(4)：606-8.

8Qu DW，Xu HS，Han XJ，etal.Expression of cyclinD1 and Ki-67 proteins in gliomas and its clinical significance〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014；18(4)：516-9.

〔2015-08-26修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)

通訊作者：齊玲(1974-)，女，副教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腦腫瘤藥物研究。

基金項目：吉林省科技廳項目(20140414049GH)；吉林省衛(wèi)生廳項目(2014Z104)

中圖分類號〔〕R282.7〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7011-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.020