張曉霞　許　濤

(武漢市普愛醫(yī)院，湖北　武漢　430030)

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支氣管哮喘大鼠肺組織中Wnt5a/JNK 信號通路相關(guān)分子表達

張曉霞許濤

(武漢市普愛醫(yī)院，湖北武漢430030)

摘要〔〕目的對支氣管哮喘大鼠肺組織 Wnt5a/JNK 信號通路相關(guān)分子的表達進行研究。方法將36只健康清潔級SD大鼠隨機分為模型組和對照組，每組18只，模型組制備大鼠哮喘模型，采用HE染色法觀察兩組氣道病理生理變化，通過實時熒光定量 PCR對兩組肺組織及血液中 Wnt5a mRNA的表達進行研究，通過Western印跡法對肺組織中磷酸化的 c-Jun和c-JunN 端激酶蛋白的表達進行檢測。結(jié)果在激發(fā)后，模型組出現(xiàn)呼吸困難、大小便失禁、皮膚發(fā)紺等癥狀；隨著激發(fā)時間的延長，對照組大鼠無明顯異常。大體觀察，模型組雙肺增大明顯，肺組織表明出現(xiàn)形狀不規(guī)則的充血區(qū)；對照組肺組織呈現(xiàn)正常的粉紅色，無明顯出血點；光鏡下發(fā)現(xiàn)模型組支氣管呈管腔狹窄，黏膜皺褶較多，呈增厚狀態(tài)，氣管及血管可見炎癥細胞浸潤，氣道壁增厚，說明哮喘模型造模成功；實時熒光定量PCR檢測Wnt5a的融解曲線呈現(xiàn)單峰狀態(tài)，而在擴增曲線中顯示Ct的間隔值相對較均勻，說明Wnt5a熒光定量PCR檢測擴增曲線相對比較特異，相對比較理想。與對照組相比，模型組肺組織及外周血單核細胞中Wnt5a mRNA的表達量均增加明顯(P<0.05)；模型組p-JNK、p-c-Jun 蛋白的表達量明顯高于對照組(P<0.05)。結(jié)論Wnt5a /JNK 信號通路的相關(guān)分子在哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中表達增強，說明Wnt5a /JNK 信號通路在哮喘的發(fā)生過程中可能被激活。

關(guān)鍵詞〔〕哮喘；Wnt5a/JNK信號通路

第一作者：張曉霞(1984-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事呼吸病學(xué)研究。

支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥，主要特點是氣道高反應(yīng)性、炎癥細胞浸潤及氣道重塑〔1〕。Wnt 家族是一類分泌性糖蛋白，具有高度保守的特點，Wnt 信號通路具有在進化上高度保守、生物效應(yīng)較為廣泛的特點，主要通過與多細胞動物的不同受體結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔2〕。有學(xué)者〔3〕通過基因分析的方式對Wnt 通路與哮喘的相關(guān)性進行研究發(fā)現(xiàn)，哮喘是由多種炎癥因子和細胞參與的，以氣道高反應(yīng)和重建為特點的慢性炎癥性疾病，信號通路在哮喘的發(fā)生及發(fā)展過程中起著重要的作用。有學(xué)者〔4〕研究顯示激活的Wnt5a/c-JunN 端激酶(JNK)信號通路能夠?qū)е轮袠猩窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥反應(yīng)，哮喘本身也是一種慢性氣道炎癥，本研究觀察Wnt5a/JNK 信號通路相關(guān)分子在哮喘SD大鼠中的表達。

1材料與方法

1.1試驗動物與試劑健康清潔級SD大鼠36只，購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院，飼養(yǎng)環(huán)境室溫恒定，保持濕度55%～60%，光照12 h/d，體重250～300 g，隨機分為模型組和對照組，每組18只。RNA提取試劑盒、卵白蛋白(OVA)特殊飼料、氫氧化鋁凝膠購自Sigma公司，兔抗大鼠磷酸化的JNK(p-JNK)抗體、兔抗大鼠磷酸化的c-Jun(p-c-Jun)抗體由Cell Signaling 公司生產(chǎn)。

1.2制備SD大鼠哮喘模型〔5〕將氫氧化鋁凝膠、OVA特殊飼料及生理鹽水按照比例1 g∶1 g∶1 ml的比例調(diào)制哮喘致敏液，并充分混勻。將混合液皮下注射至SD大鼠的腹部、雙側(cè)腹股溝、腹腔及前足跖部位，注射時間為第1、8天，每個部位注射0.2 ml，第15天配制霧化吸入液(OVA用生理鹽水稀釋，濃度為10 g/L)，在密閉的有機玻璃容器中，通過空氣壓縮霧化器給予霧化吸入激發(fā)，每天霧化激發(fā)1次，每次30 min，連續(xù)激發(fā)7 d。對照組在相同時間和條件下，給予高壓滅菌生理鹽水代替致敏液和激發(fā)液進行致敏和激發(fā)過程。

1.3分離提取單核細胞完成致敏和激發(fā)過程后，將大鼠麻醉，取其腹主動脈血5 ml并加入等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分混合均勻，取1支離心管，在離心管中加入5 ml淋巴細胞分離液，將混合液緩緩倒入裝有淋巴細胞分離液的離心管中，離心20 min(2 000 r/min)，離心后用吸管將白膜層(淋巴細胞層)移入到新的離心管中，加入PBS液反復(fù)離心、洗滌2遍，所得沉淀即單核細胞。

1.4肺組織標本病理學(xué)觀察打開麻醉SD大鼠胸腔，大體觀察肺臟外觀，取適量新鮮肺組織，用生理鹽水漂洗后濾紙吸干，用4%多聚甲醛固定7 d后，脫水、包埋、切片后行HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察肺組織的病理變化。

1.5熒光實時定量PCR檢測肺組織和單核細胞Wnt5a mRNA 的表達①根據(jù)基因庫提供的已知基因序列，采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計Wnt5a引物，內(nèi)參基因為GAPDH，由上海英駿生物工程公司合成。見表1。②根據(jù)RT-PCR試劑盒檢測步驟提取肺組織及外周血總RNA，采用熒光定量儀進行擴增肺組織及外周血中Wnt5a mRNA，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃退火和延長5 s，60℃ 20 s，循環(huán)45次。PCR反應(yīng)結(jié)束后，制定最佳閾值線，找出Ct值，設(shè)定正常對照組基因表達為1，獲得其他各組 Wnt5a 表達的相對值。③采用雙辛丁酸(BCA)法提取SD大鼠肺組織總蛋白，取50 g 蛋白進行上樣，電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在脫脂奶粉中室溫條件下封閉2 h，加入兔抗 p-c-Jun抗體(1∶1 000)和兔抗 p-JNK 抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，PBS充分洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG(1∶5 000)，室溫下孵育1 h，辣根過氧化物酶(DAB)法進行顯色，用ImageJ圖像分析系統(tǒng)進行吸光度值分析，結(jié)果用檢測蛋白的吸光度值/內(nèi)參蛋白的吸光度值來表示表示。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

表1熒光-PCR基因引物序列及產(chǎn)物堿基數(shù)

引物序列產(chǎn)物堿基數(shù)Wnt5a上游5'-CATAGGAGCACAGCCTCTCTG-3'126bp 下游5'-CACTCTTTGATGCCCGTCTT-3'GAPDH上游5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'252bp 下游5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'

2結(jié)果

2.1兩組致敏和激發(fā)后出現(xiàn)的癥狀及病理學(xué)觀察激發(fā)后，模型組出現(xiàn)呼吸困難、大小便失禁、皮膚發(fā)紺等癥狀。隨著激發(fā)時間的延長，對照組無明顯異常。模型組雙肺增大明顯，肺組織表明出現(xiàn)形狀不規(guī)則的充血區(qū)；對照組肺組織呈現(xiàn)正常的粉紅色，無明顯出血點；光鏡下發(fā)現(xiàn)模型組支氣管呈管腔狹窄，黏膜皺褶較多，呈增厚狀態(tài)，氣管及血管可見炎癥細胞浸潤，氣道壁增厚，說明哮喘模型造模成功。

2.2兩組肺組織及外周血單核細胞中Wnt5a mRNA的表達實時熒光定量PCR檢測Wnt5a的融解曲線呈現(xiàn)單峰狀態(tài)，而在擴增曲線中顯示Ct的間隔值相對較均勻，說明Wnt5a熒光定量PCR檢測擴增曲線相對比較特異，相對比較理想。與對照組相比，模型組肺組織及外周血單核細胞中Wnt5a mRNA的表達量均增加明顯(P<0.01)。見表2。

2.3兩組肺組織 p-JNK、p-c-Jun 蛋白的表達模型組p-JNK、p-c-Jun 蛋白的表達量明顯高于對照組(P<0.01)。見表3，圖1。

組別肺組織外周血單核細胞模型組2.55±1.364.52±1.86對照組1.03±0.730.97±0.46t/P值4.178/0.00067.861/<0.01

組別p-JNKp-c-Jun模型組1.35±0.111.42±0.09對照組0.81±0.080.78±0.07t/P值15.826/<0.0123.815/<0.01

圖1　兩組肺組織 p-JNK、p-c-Jun 蛋白的表達

3討論

支氣管哮喘主要的病理生理變化是慢性氣道炎癥，哮喘發(fā)生過程中肥大細胞、嗜酸粒細胞、中性粒細胞、T細胞等細胞存在于支氣管上皮細胞損傷和損傷后修復(fù)的病理生理過程〔6〕。哮喘目前主要的治療方式是以激素治療為主，而采用激素治療容易導(dǎo)致患兒生長延遲，進而影響到患者成年后的身高〔7〕。學(xué)者〔8，9〕研究顯示哮喘患者 Wnt 信號通路會明顯發(fā)生變化，表明哮喘的發(fā)生發(fā)展過程可能與Wnt 信號通路有明顯的相關(guān)性。

研究〔10〕顯示在各種炎癥性疾病中如類風濕關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎中Wnt5a表達明顯增加，表明Wnt5a在炎性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。有學(xué)者〔11〕研究顯示W(wǎng)nt5a在哮喘小鼠肺組織中異常高表達。有學(xué)者〔12〕研究顯示W(wǎng)nt5a主要是通過激活JNK而在Wnt 信號通路中發(fā)揮作用。JNK是一種蛋白激酶，在傳遞過程中具有高度保守的特點，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，JNK在細胞的增殖、分化、生長及凋亡的過程中發(fā)揮重要的作用，與細胞的應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)有明顯的關(guān)系。有學(xué)者通過加入JNK性抑制劑SP600125 進行研究，發(fā)現(xiàn)加入后哮喘大鼠肺嗜酸性粒細胞及IgE 和Th2 型細胞因子的表達明顯減少，哮喘大鼠氣道內(nèi)生成的黏液也明顯減少〔13〕，說明JNK在哮喘的發(fā)生發(fā)展的病理過程中起著重要的作用。本研究結(jié)果與學(xué)者〔13〕的研究結(jié)果基本一致，說明支氣管哮喘大鼠肺組織中Wnt5a/JNK 信號通路相關(guān)分子的表達均增加，說明哮喘發(fā)生發(fā)展過程中Wnt5a/JNK 信號通路有效地激活。

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〔2014-09-17修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：許濤(1971-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事重癥醫(yī)學(xué)與神經(jīng)科學(xué)研究。

基金項目：武漢市衛(wèi)生局科研項目(No.wx14c64)

中圖分類號〔〕R392.3〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7007-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.018