李媛媛　楊欽河　張金文　龔享文　王觀龍　梁蔭基　張玉佩　王　洪　金　玲　何毅芳　鄧遠軍　林春梅

(暨南大學醫(yī)學院，廣東　廣州　510632)

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疏肝健脾方藥對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細胞TLR4/p38MAPK信號通路的影響

李媛媛楊欽河張金文龔享文王觀龍梁蔭基張玉佩王洪金玲1何毅芳鄧遠軍林春梅

(暨南大學醫(yī)學院，廣東廣州510632)

摘要〔〕目的探討疏肝健脾方藥對非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠肝細胞TLR4/p38MAPK信號通路的干預作用，從炎癥角度揭示疏肝健脾方藥抗大鼠NASH的作用機制。方法選用SPF級SD大鼠120只，隨機分為8組。采用高脂飼料喂養(yǎng)建立大鼠NASH 模型，26 w后對肝組織進行HE染色，油紅O染色，全自動生化分析肝功血脂改變，ELISA檢測血清白介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量；采用離體循環(huán)灌注Ⅳ型膠原酶法分離肝細胞，流式細胞術(FCM)對肝細胞純度進行活性和純度鑒定。熒光定量PCR檢測肝細胞TLR4、p38MAPK mRNA表達量；Western印跡法檢測肝細胞蛋白TLR4、p38MAPK及磷酸化蛋白p38MAPK表達水平。結果26 w高脂飲食成功建立了NASH大鼠模型，HE染色和油紅O染色證實大鼠模型存在典型的NASH病理改變。與正常組比較，模型組血清IL-1、IL-6、 TNF-α含量顯著升高(P<0.01)；各用藥組與模型組比較，合方高、低劑量組IL-1、IL-6、 TNF-α含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，健脾高劑量組IL-1、IL-6含量降低有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。與正常組比較，模型組大鼠肝細胞TLR4、p38MAPK mRNA表達及磷酸化蛋白p38MAPK表達量顯著增加(P<0.01)；各用藥組與模型組比較，合方高、低劑量組，健脾高劑量組TLR4、p38MAPK mRNA蛋白及磷酸化蛋白p38MAPK表達量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。結論疏肝健脾方藥能夠降低NASH大鼠血清炎癥因子水平，改善NASH大鼠肝臟的病理變化，TLR4/p38MAPK可能是疏肝健脾方藥發(fā)揮抗NASH作用的藥物靶點。

關鍵詞〔〕疏肝健脾方藥；NASH；肝細胞；TLR4/p38MAPK信號通路

1暨南大學附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科

第一作者：李媛媛(1990-)，女，碩士，主要從事中西醫(yī)結合肝病研究。

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是非酒精性脂肪性肝病向肝纖維化、肝硬化甚至肝癌發(fā)生發(fā)展的一個重要病理環(huán)節(jié)〔1〕，研究NASH大鼠肝細胞與炎癥反應相關基因的相互關系已成為NASH發(fā)病機制的研究熱點〔2～4〕。研究表明，TLR4/p38MAPK與脂肪肝的發(fā)生發(fā)展密切相關〔5,6〕，但其詳細機制未明。本研究擬觀察疏肝健脾方藥對NASH大鼠肝細胞TLR4/p38MAPK通路的影響，從炎癥角度探討該方藥抗NASH的作用機制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物120只SPF級雄性SD大鼠，體重(200±20)g,購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物管理中心(批號：No.0107792)，許可證號：SCXK(粵)2008-0020。動物飼養(yǎng)于暨南大學實驗動物管理中心〔許可證號：SYXK(粵)2012-0117〕。

1.1.2主要試劑胎牛血清(美國Hyclone公司)；Ⅳ型膠原酶(美國Life Technologies公司)；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1 和IL-6 ELISA試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司)；抗p38MAPK、抗p-p38MAPK、抗-TLR4一抗(美國Cell Signaling Technology公司)；SYBR Premix Ex Taq PCR試劑盒(日本Takara公司)。

1.1.3實驗藥物(1)疏肝方：柴胡疏肝散(柴胡6 g，芍藥5 g，香附5 g，枳殼5 g，陳皮6 g，川芎5 g，炙甘草3 g)；(2)健脾方：參苓白術散(人參15 g，茯苓15 g，白術15 g，薏苡仁9 g，白扁豆12 g，砂仁6 g，山藥15 g，桔梗6 g，蓮子9 g，炙甘草9 g)；(3)綜合方：柴胡舒肝散與參苓白術散的合方。

方劑組成、劑量均參照《方劑學》教材〔7〕。給藥劑量按人和動物體表面積折算，方藥低劑量組相當于人類臨床等效劑量，高劑量組相當于3倍人類臨床等效劑量。中藥為深圳華潤三九醫(yī)藥股份有限公司中藥配方顆粒劑，均購于暨南大學附屬第一醫(yī)院中藥房。

1.2方法

1.2.1實驗分組及用藥120只大鼠，適應性飼養(yǎng)1 w后，根據體重隨機分為8組，每組15只，其中9只檢測常規(guī)指標，6只提取肝細胞，分別為正常組、模型組、疏肝高/低劑量組、健脾高/低劑量組、合方高/低劑量組。除正常組大鼠給予基礎飼料喂養(yǎng)外，其余各組均以高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)26 w。在造模的同時，正常組及模型組按10 ml/kg BW量給予蒸餾水灌胃干預，用藥組給予相應藥物灌胃干預：疏肝高劑量組(灌服疏肝方9.6 g·kg-1·d-1)、疏肝低劑量組(灌服疏肝方3.2 g·kg-1·d-1)、健脾高劑量組(灌服健脾方30.0 g·kg-1·d-1)、健脾低劑量組(灌服健脾方10.0 g·kg-1·d-1)、綜合方高劑量組(灌服疏肝健脾合方39.6 g·kg-1·d-1)、綜合方低劑量組(灌服疏肝健脾合方13.2 g·kg-1·d-1)。由于灌胃操作不當，健脾高劑量組與合方高劑量組各死亡1只大鼠。

1.2.2指標檢測及方法

1.2.2.1肝組織病理學觀察模型建立成功后，每組取9只，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，采集肝組織，行HE染色與油紅O染色觀察肝組織病理變化。

1.2.2.2血脂、細胞因子檢測適量肝組織勻漿取上清，用全自動生化分析儀檢測肝組織高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量，ELISA檢測血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量。

1.2.2.3肝細胞的分離與鑒定

1.2.2.3.1肝細胞的分離與制備在前期細胞分離與鑒定的基礎上加以改進〔8〕,各組大鼠以3%的戊巴比妥鈉(1 ml/kg BW)腹腔麻醉，呈U形切口切開腹部，暴露肝臟，游離肝門靜脈及下腔靜脈，并結扎固定。采用離體循環(huán)灌注Ⅳ型膠原酶，差速離心、密度梯度離心和選擇性貼壁分離肝細胞。

1.2.2.3.2肝細胞的純化與鑒定 收集未純化的肝細胞，在沉淀中加入10%胎牛血清1640培養(yǎng)基，垂懸后以混懸液∶Typan blue=9∶1比例染色，計數肝細胞，以4×106個/ml接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)12 h后，90%以上的肝細胞貼壁，PBS洗掉未貼壁的細胞，得到純化的肝細胞。經胰蛋白酶消化后以PBS吹打后離心去上清獲得肝細胞，加入固定劑15 min，添加破膜試劑，加入一抗兔抗大鼠抗CK18；室溫孵育30 min，加二抗羊抗兔IgG-FITC， 30 min后，再加破膜試劑洗滌2次，流式細胞儀鑒定肝細胞純度。

1.2.2.4熒光定量PCR檢測肝細胞TLR4、p38MAPK mRNA的表達從GenBank里查找基因TLR4、p38MAPK、IKKβ、NF-κB序列號，引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計并合成。TLR4：上游引物：5′-AAGTTATTGTGGTGGTGTCTAG-3′，下游引物：5′-GAGGTAGGTGTTTCTGCTAAG-3′，148 bp；p38MAPK：上游引物5′-TTGGTCTGTTGGATGTGTTTAC-3′，下游引物5′-TGGATTATGTCAGCCGAGTG-3′，193 bp；GAPDH：上游引物5′-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3′，134 bp。

PCR按照試劑盒說明書進行操作，采用25 μl反應體系，反應條件：①95℃持續(xù)30 s預變性；②95℃持續(xù)5 s變性；③GAPDH 57.5℃，TLR4 58℃，p38MAPK 58℃，退火20 s；④ 60℃持續(xù)30 s 延伸，②～④39個循環(huán)；⑤溶解曲線分析，70℃～ 90℃，持續(xù)5～10 s。反應完畢采用Opticon Monitor 3.1 軟件分析，用公式2-△△Ct方法進行相對定量。

1.2.3Western印跡檢測肝細胞TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達取適量裂解液，使用前先加入PMSF，使PMSF終濃度為1 mmol/L。計數細胞，按照每6×106個細胞加入1 ml RIPA裂解液，4℃，12 000 r/min離心5 min，根據碧云天公司BCA蛋白濃度試劑盒說明書對蛋白含量進行測定。肝細胞樣本進行凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、4℃過夜。洗滌后加入二抗，孵育，充分洗滌，然后進行化學發(fā)光。曝光、 顯影、 定影,最后對結果進行光密度掃描分析。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0軟件，計量資料采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊時用S-N-K法進行組間比較，方差不齊時用TamhaneT2法檢驗。

2結果

2.1HE染色結果模型組大鼠肝組織切片脂肪變性明顯，可見肝細胞腫脹、有氣球樣變，偶可見散在壞死的肝細胞，肝索紊亂，伴炎癥細胞為主的肝小葉內、匯管區(qū)炎癥浸潤；胞質內可見大小不一的脂滴，呈圓形，以大泡性脂滴為主，部分細胞酷似脂肪細胞，胞核被擠壓、靠向邊緣。正常組大鼠肝組織結構完好，小葉結構清晰，肝竇結構正常，肝細胞結構完整，排列整齊，呈多邊形，胞質紅染，無空泡，胞核位于中央，無明顯病變。各藥物干預組大鼠肝組織脂肪變性及炎癥浸潤情況較模型組均有不同程度的改善，以合方高、合方低、健脾高劑量組改善最為明顯。見圖1。

圖1　HE染色(×200)

2.2油紅O染色結果模型組肝細胞腫脹，核質深藍染色、靠邊，胞質可見大片的紅色脂滴，小葉結構破壞，肝索紊亂；正常組肝細胞排列整齊，胞核淡藍居中，結構正常，胞質偶見正常散在的紅染脂滴；各藥物干預組紅染脂滴量介于正常組與模型組之間，其中以合方高、合方低、健脾高劑量組脂滴較少。見圖2。

圖2　油紅O染色(×200)

2.3血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量與正常組比較，模型組大鼠TC、TG、LDL-C均有顯著升高，HDL-C均有顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，合方高、低劑量組、健脾高劑量組大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C顯著改善(P<0.05，P<0.01)，健脾低劑量組LDL-C降低有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.4大鼠血清IL-1、IL-6、 TNF-α含量模型組大鼠血清IL-1、IL-6、 TNF-α與正常組比較含量顯著升高(P<0.01)；各用藥組與模型組比較，合方高、低劑量組IL-1、IL-6、 TNF-α含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，健脾高劑量組IL-1、IL-6含量顯著降低(P<0.05)；其余各組與模型組比較有下降趨勢，但是差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各用藥組間比較，與健脾低組比較，合方組TNF-α降低有統(tǒng)計學差異(P<0.05，P<0.01)，與健脾高組比較，合方高組IL-6顯著降低(P<0.05)，見表2。

組別nTCTGHDL-CLDL-C正常組91.42±0.180.61±0.151.16±0.111.07±0.19模型組93.30±0.201)1.19±0.271)0.52±0.051)2.69±0.271)疏肝高組93.06±0.240.99±0.130.64±0.082.49±0.26疏肝低組93.22±0.291.07±0.220.53±0.162.56±0.35健脾高組82.54±0.273)0.94±0.203)0.69±0.092)2.06±0.292)健脾低組93.28±0.181.04±0.170.60±0.082.41±0.243)合方高組81.88±0.182)4)5)0.74±0.182)4)5)1.07±0.072)4)5)1.72±0.262)4)5)合方低組92.52±0.163)0.93±0.133)0.66±0.093)2.15±0.233)

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01,3)P<0.05；與健脾高組、合方低組比較：4)P<0.05；與疏肝組、健脾低組比較：5)P<0.01

2.5原代肝細胞的鑒定肝細胞組CK-18 抗體檢測肝細胞，檢測細胞1×104個，CK-18 受體表達細胞數為9 080個，細胞所占比為90.80%，則肝細胞純度為90.80%。

組別nIL-1IL-6TNF-α正常組994.58±22.1362.20±15.63107.24±21.62模型組9185.29±25.081)147.27±16.611)241.43±25.031)疏肝高組9146.65±18.52126.12±11.58198.09±22.57疏肝低組9151.82±18.71130.21±12.72204.41±23.38健脾高組8120.17±16.842)115.35±11.13176.12±21.122)健脾低組9144.21±22.51126.19±14.85196.23±22.49合方高組8111.87±17.423)74.29±11.563)4)129.45±21.063)5)合方低組9122.55±17.322)81.20±11.653)133.53±21.632)5)

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；與健脾高組比較：4)P<0.05，與健脾低組比較：5)P<0.05

2.6肝細胞p38MAPK通路相關基因及蛋白檢測模型組大鼠肝細胞TLR4、p38MAPK mRNA及蛋白與正常組比較表達量顯著增加(P<0.01)；各用藥組與模型比較，合方高、低劑量組，健脾高劑量組TLR4、p38MAPK mRNA及蛋白表達量顯著降低(P<0.05，P<0.01)；其余各用藥組與模型組比較均有不同程度下降趨勢，但是差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。用藥組間比較，合方高、低組與疏肝組、健脾低組比較TLR4、p38MAPK mRNA及蛋白表達量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，其中合方高組TLR4 mRNA與健脾高組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，健脾高組與疏肝組、健脾低組比較p38MAPK蛋白表達顯著降低(P<0.01)。見表3，表4，圖3。

組別TLR-4p38MAPK正常組1(0.88～1.14)2)1(0.80-1.25)2)模型組4.89(4.12～5.81)1)4.56(4.06-5.13)1)疏肝高組3.93(3.70～4.17)3.76(3.43～4.14)疏肝低組4.18(3.69～4.73)4.01(3.52～4.63)健脾高組3.25(2.68～3.95)3)3.02(2.49～3.63)3)健脾低組3.98(3.51～4.50)3.95(3.57～4.38)合方高組1.59(1.37～1.86)2)4)6)7)1.82(1.49～2.22)2)4)8)合方低組2.01(1.59～2.77)2)2.39(1.88～3.05)2)5)7)

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；與疏肝組比較：4)P<0.01，5)P<0.05；與健脾高組比較：6)P<0.01；與健脾低組比較：7)P<0.01，8)P<0.01

組別p38MAPKp-p38MAPKTLR4正常組0.94±0.040.28±0.060.27±0.09模型組2.04±0.071)1.01±0.081)1.01±0.081)疏肝高組1.85±0.080.89±0.090.82±0.09疏肝低組1.89±0.070.95±0.050.89±0.11健脾高組1.46±0.082)4)7)0.79±0.083)0.71±0.103)健脾低組1.82±0.120.90±0.070.83±0.12合方高組1.23±0.102)4)7)0.43±0.092)4)9)0.46±0.072)4)7)合方低組1.35±0.092)4)7)0.52±0.0462)4)7)0.55±0.092)4)6)

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；疏肝組比較：4)P<0.01，5)P<0.05；與健脾低組比較：6)P<0.05，7)P<0.01；與健脾高組比較：8)P<0.05，9)P<0.01

A:正常組;B:模型組;C:疏肝高組;D:疏肝低組;E:健脾高組;F:健脾低組;G:合方高組;H合方低組圖3　肝細胞p38MAPK信號通路相關蛋白灰度值比較

3討論

NASH大多歸屬于中醫(yī)肝癖、脅痛等病證范疇〔9〕。本實驗采用高脂飼料喂養(yǎng)26 w后成功建立SD大鼠NASH模型，病理組織學表明肝臟脂肪變性同時伴有炎癥和壞死，提示NASH大鼠模型建立成功，這與王敏等〔10〕的研究結果一致。

研究表明，在NASH疾病進程中，外周脂肪組織動員增加可導致游離脂肪酸(FFA)入肝增多，增強TG合成能力；HDL-C合成及分泌減少促使LDL-C合成增加，Ch含量升高，從而導致TG轉運出肝減少，最終導致脂質代謝紊亂的病理演變〔11〕。本研究結果表明NASH大鼠存在脂質代謝紊亂；疏肝健脾方藥可以明顯改善NASH大鼠血脂代謝、減輕NASH大鼠肝組織脂肪蓄積，以合方高劑量組效果最佳，合方低劑量組與健脾高劑量組次之。

p38MAPK通路在MAPK信號通路中發(fā)揮重要作用〔12〕,是近年來信號傳導領域研究的熱點之一。p38MAPK在細胞炎癥反應、細胞凋亡等過程中起重要作用〔13〕。p38MAPK通路的激活與炎癥因子釋放的機制復雜，研究表明〔14,15〕，阻斷p38MAPK信號通路能夠減輕炎癥反應，抑制脂多糖誘導IL-1、IL-6及TNF-α等炎性細胞因子的釋放。TLR4的活化是內、外源性內毒素誘導炎癥發(fā)生的關鍵，它的激活在細胞內信號轉導致肝損傷的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。TLR4和氧化應激的相互作用導致肝臟對TLR4的配體及細胞因子的敏感性增加，而加重肝損傷〔16〕。本研究結果提示，NASH大鼠肝細胞中存在TLR4、p38MAPK mRNA及TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白高表達，疏肝健脾方藥對NASH大鼠肝細胞TLR4、p38MAPK mRNA及TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達有下調作用，其中以合方高、低劑量組，健脾高劑量組最明顯，在26 w階段疏肝健脾合方效果最佳。疏肝健脾方藥可能是通過下調p38MAPK通路關鍵基因及蛋白發(fā)揮抗NASH作用。

循證醫(yī)學研究表明：中醫(yī)藥對NASH的防治作用明確，療效肯定〔17〕。本課題組前期研究表明，參苓白術散有明顯降低血脂、改善肝臟脂肪變性，調控炎癥反應、保護肝臟等作用〔18～20〕；另外，結合臨床治療觀察發(fā)現NAFLD患者病因病機多為肝郁脾虛型，以此確立疏肝健脾法為基本治法，具有確切的療效〔21〕，但具體機制未明。本研究結果顯示，疏肝健脾方藥能夠改善NASH大鼠肝組織的脂肪變，下調炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的水平，明顯調控大鼠肝細胞p38MAPK信號通路的活化，改善脂質代謝紊亂及炎性改變，但以合方組療效最為顯著。根據以方測證的方法，肝郁脾虛可能是NASH此階段的基本病機，TLR4/p38MAPK蛋白可能是疏肝健脾方藥發(fā)揮抗NASH作用的藥物靶點。

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〔2015-04-15修回〕

(編輯曲莉)

Effects of Shugan-Jianpi prescriptions on TLR4/p38MAPK signaling pathway in hepatocytes of rats with NASH

LI Yuan-Yuan,YANG Qin-He,ZHANG Jin-Wen,etal.

Medical School of Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong,China

【Abstract】ObjectiveTo discuss the influence of Shugan and Jianpi methods and prescriptions on TLR4/p38MAPK signaling pathways in hepatocytes of rats with NASH and reveal the mechanisms.Methods120 SPF SD male rats were divided into 8 groups randomly. After 26 weeks,liver pathology of the rats was analyzed by HE and Oil red O staining.The levels of TC,TG,LDL-C,HDL-C in blood serum were detected. Then the levels of IL-1,IL-6,TNF-α of blood serum were analyzed by ELISA. Cell activity and purity were appraised by FCM technical. TLR4 and p38MAPK mRNA and protein expressions of hepatocytes were analyzed by fluorescence quantitative PCR and Western blot.ResultsThe levels of serum IL-1,IL-6,TNF-α were increased in normal group than those in model group (P<0.01). Comparing with those of model group,the levels of IL-1,IL-6,TNF-α were reduced significantly in high and low integrated prescriptions groups (P<0.05，P<0.01),the levels of IL-1,IL-6 were decreased in high Jianpi prescriptions group (P<0.05). The levels of TLR4,p38MAPK mRNA,protein phosphorylation p38MAPK in rats hepatocyte were increased in model group than those in normal group (P<0.01),and they were decreased in high and low integrated prescriptions,high Jianpi recipe groups than those in model group (P<0.05，P<0.01).ConclusionsShugan-Jianpi prescriptions could reduce the serum inflammatory factors and prevent liver′s steatosis of the NASH rats,and TLR4/p38MAPK might be the targets of Shugan-Jianpi prescriptions in the treatment of NASH.

【Key words】Shugan-Jianpi prescriptions;NASH;Hepatocytes;TLR4/p38MAPK signal pathway

通訊作者：楊欽河(1961-),男，教授，主任醫(yī)師，博士后，博士生導師，主要從事中西醫(yī)結合治療肝病的基礎與臨床研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(81273617，30973694；81302878)

中圖分類號〔〕R575.5〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6649-05；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.004