王　新，易思萌,，劉慧芳,，馬　凱，范君文，馬雨楠，游　穎，孫兆增

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學，青島　266109； 2. 軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京　100071)

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獼猴B病毒囊膜蛋白gD基因真核細胞表達載體的構建及表達

王新1，易思萌1,2，劉慧芳1,2，馬凱1，范君文2，馬雨楠2，游穎2，孫兆增2

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學，青島266109； 2. 軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京100071)

【摘要】目的構建獼猴B病毒囊膜蛋白gD的真核表達載體，并且檢測其在293T細胞內的表達情況。 方法 首先通過基因合成手段獲得含B病毒gD蛋白的基因片段，在經(jīng)由PstⅠ和NotⅠ雙酶切后連接到pEGFP-N3載體，隨后將構建的pEGFP-N3-GD重組質粒轉染到人胚胎腎上皮細胞系293T細胞。再用Western blot檢測所提蛋白其在細胞內的表達情況，并用激光共聚焦分析其在細胞內的表達定位情況。 結果 成功獲得攜帶gD基因的陽性重組質粒pEGFP-N3-GD，且pEGFP-N3-GD重組質粒能在293T細胞的表面正常表達。 結論 利用真核表達系統(tǒng)，既能夠在細胞表面產(chǎn)生B病毒gD蛋白的特異性重組抗原，而且可用于B檢測抗原的制備。

【關鍵詞】獼猴B病毒；gD蛋白；載體構建；真核表達

Construction of eukaryotic vector of monkey B virus

猴B病毒，也叫猴皰疹病毒I型(cercopithecine herpesvirus I)，α-皰疹病毒亞科，單純皰疹病毒屬。和它同一種屬的還有會引起人口腔潰瘍的單純皰疹病毒1型病毒(herpes simplex type 1, HSV-1)和人生殖器皰疹病毒HSV-2[1-3]。B病毒主要自然宿主是獼猴等靈長類動物，感染率極高，它可使恒河猴引起一過性的皰疹樣口炎，于7～14 d內自愈，但卻能使人類等非自然宿主動物出現(xiàn)致死性的腦炎或上行性腦脊髓炎(死亡率超過70%)[1-3]，正是由于其對人生命安全的高度威脅性，而被歸于生物安全4級病原。在B病毒的快速檢測方面，國內目前主要使用的檢測抗原是HSV-1 和 HSV-2，而國外主要使用的檢測抗原是SA8 和 HVP-2 等同源病毒[3，4]，雖然這些病毒抗原具有較高的安全性，但同樣較高的抗原交叉性致使B病毒的檢測誤差可達3%～10%。同樣在B病毒的有效防治方面，受制于檢測抗原的影響，對其防治辦法的深入研究與防治效果的追蹤反饋也相應的遇到了瓶頸。因此，找尋安全高效的特異性抗原對于研究獼猴B病毒的有效防治與快速診斷十分重要。

蛋白gB、gC、gD和gG等，均屬于B病毒不同類型的囊膜蛋白，不同類型的囊膜蛋白在B病毒的復制傳播中所起到的作用也各有不同。囊膜gD蛋白，它主要負責參與獼猴B病毒的吸附、膜融合和入侵；同時又與病毒的傳播以及逃避機體免疫監(jiān)視有著密切的關系。這些糖蛋白是獼猴B病毒檢測的主要候選抗原，其中囊膜蛋白gB，其敏感性最高(99%)，但特異性最低。gG重組蛋白的檢測特異性最好(97.5%)，但敏感性只有80%[5]； 而重組蛋白gD的檢測敏感性較gG要高，且特異性較較gB要好，因此，gD重組蛋白是獼猴B病毒診斷的有效抗原。

本實驗構建的重組真核細胞表達載體pEGFP-N3-gD(含gD基因片段)，并將其轉染293T細胞，確認gD重組蛋白可在293T細胞的表達，為進一步研究gD蛋白對獼猴B病毒生物學功能的影響，以及將重組蛋白gD作為獼猴B病毒快速診斷用特異性抗原的研究提供相應的支持。

1材料和方法

1.1材料

獼猴B病毒gD胞外區(qū)基因序列由博邁德合成，DH5α感受態(tài)細胞、質?；厥赵噭┖?、膠回收試劑盒、DNA marker 2000、DNA marker 10000、2× Taqmix購自北京博邁德生物公司。轉染試劑Lipofectamine 2000購自 Invitrogen 公司。細胞培養(yǎng)試劑購自 Hyclone 公司。Myc標簽一抗購自AB-mart公司。T4連接酶、限制性內切酶PstⅠ和NotⅠ等，來自 Takara公司。山羊抗小鼠IgG(辣根過氧化物酶標記)，采購自中杉金橋公司。

1.2方法

1.2.1gD基因合成：gD為糖蛋白的一種，具有明顯糖蛋白的特質，基因序列由胞外區(qū)、胞內區(qū)和跨膜區(qū)組成。根據(jù)其基因序列，合成基因片段，長度約為1 304 bp，主要包括gD蛋白的胞外區(qū)域。并在基因的5`端引入了MHC I類分子的信號肽序列和PstI酶切位點，在基因3`端引入myc標簽序列和NotI酶切位點。設計完成后，由北京博邁德生物有限公司負責合成。

1.2.2pEGFP-N3-gD重組質粒的構建：用PstI和NotI將之前測序篩選過的gD基因片段進行雙酶切，所產(chǎn)生的基因回收產(chǎn)物利用與T4連接酶pEGFP-N3質粒相連接。 將重組質粒轉化到DH5α感受態(tài)細胞，利用卡那抗性的平板進行選擇性培養(yǎng)，并進一步使用PCR的方法篩選出陽性克隆，最終選出的PCR陽性質粒再利用酶切的方法進一步鑒定。

1.2.3細胞培養(yǎng)和重組質粒的轉染：在DMEM培養(yǎng)基中(內含10%的胎牛血清)培養(yǎng)的293T細胞，并傳代至6孔培養(yǎng)板。在培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)到70%~80%時(在6孔板中)，再用Lipofectamine 2000 轉染重組質粒。然后將這些細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d或2 d后，收集這些細胞進行接下來的實驗。

1.2.4Western blot 免疫印跡實驗：用細胞核—胞漿—胞膜制備試劑盒來提取蛋白，吸取40 μL總蛋白進行10% SDS-PAGE蛋白電泳，然后轉移到PVDF膜上進行Western-blot檢測。用脫脂奶粉(濃度為5%)來封閉PVDF膜，在兩個小時以后加入Myc一抗(1∶5 000)；置于4℃搖床上，孵育12 h，充分洗滌后，再加入山羊抗鼠的二抗(1∶8 000)，在室溫下培養(yǎng)1 h，TBST緩沖液洗滌3次，然后加入發(fā)光顯色劑，再置于暗室用X光進行曝光、顯影。利用β-actin蛋白作為對照。

1.2.5細胞表達定位實驗：轉染后的293T細胞在繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，使用4%多聚甲醛進行固定，對細胞的固定一般需要15 min，之后再用0.3% Triton X-100透化處理。以上處理完成后，加入10% BSA封閉，再用myc標簽的一抗和FITC熒光的二抗孵育之后，接著用濃度為1 μg/mL的RNase(1ml/孔)消化RNA，最后加入PI，600 μL左右染色10 min。再用適量的抗熒光猝滅封固液，封片固定。之后利用德國蔡司公司生產(chǎn)的Zeiss Ism 510 Meta 熒光共聚焦成像顯微鏡進行觀察、拍照。

2結果

2.1基因合成結果分析

利用PCR法鑒定已合成gD基因，試驗結束后所得的結果顯示，目的片段的大小與預期結果相符，目的片段大小為1 000～2 000 bp之間(圖1)，而預期結果大小為1 400 bp左右。并且在測序后，根據(jù)所得結果可知，這段經(jīng)PCR鑒定的gD基因與恒河猴gD基因的同源性可達100%。

圖1　gD基因片段的PCR擴增結果Note. M：Marker 2000；Fig.1　PCR amplification results of gD protein

2.2 pEGFP-N3-gD重組質粒的構建結果分析

利用T4連接酶，將已經(jīng)合成的gD基因定向的連接到pEGFP-N3載體。利用利用PCR方法篩選陽性重組質粒。并利用雙酶切法的方法進行鑒定。結果如圖2，表明經(jīng)雙酶切后的陽性重組質粒pEGFP-N3-gD，分別在5 000 bp左右和1 000 bp左右切成兩個片段，由此可知gD成功克隆到pEGFP-N3載體上。

注：M：DNA分子量標準；1:重組質粒pEGFP-N3-GD的PstⅠ和NotⅠ雙酶切結果圖2　雙酶切鑒定重組質粒pEGFP-N3-GDNote. M：DNA molecular standard；1: The products of enzyme digestion with PstⅠand NotⅠFig.2　Enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pEGFP-N3-GD

2.3 pEGFP-N3-gD的Western-Blot鑒定

利用Western-Blot對pEGFP-N3-gD的表達情況進行鑒定。試驗初預測pEGFP-N3-gD分子量為45 kDa，而由圖3顯示的實驗結果分子量在50 kDa左右。說明gD重組蛋白可以在293T細胞內進行準確翻譯，并可能進行了一定的翻譯后加工修飾。

注：M:低水平蛋白；1-4：pEGFP-N3-gD基因的表達鑒定結果。圖3　gD基因表達的western-blot鑒定Note. M: Low molecular weight protein marker；1-4: Identification of the gD expression.Fig.3　Identification of the expression of gD protein by Western-blotting

2.4 pEGFP-N3-gD在細胞內的定位表達

利用激光共聚焦顯微鏡觀察gD 基因在293T細胞的表達情況，觀察它們轉染后的形態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)，(其重組蛋白)能發(fā)出綠色熒光(在經(jīng)過FITC標記抗體染色)，但是，由PI染色過的細胞核發(fā)出的熒光卻為紅色。由圖4(見文后彩插2)可知，pEGFP-N3-gD重組蛋白主要在細胞膜上進行表達，可能是MHC I類分子(附加在gD蛋白前端)的信號肽引導gD蛋白在細胞膜上表達。

3討論

近年來，關于獼猴B病毒gD囊膜蛋白在B病毒的診斷和防治方面的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，gD囊膜蛋白可以作為誘導機體產(chǎn)生免疫應答的主要靶點之一，國外的研究者曾經(jīng)以B病毒gD蛋白基因為基礎設計DNA疫苗；進一步的實驗證實能誘導猴產(chǎn)生免疫應答，并對B病毒有一定的中和保護作用[6]。另外一個課題組的研究結果表明，將gD基因插入到痘苗病毒載體制成核酸疫苗，91%(10/11)被免疫的兔子可抵抗病毒的攻擊[7]。國內學者肖鏡等探索了利用gB、gC和gD重組蛋白以及gD的肽合成片段進行B病毒的檢測[8]；張文韜等[9]則對關于 B病毒囊膜糖蛋白gD基因的克隆及原核表達進行了研究。

真核表達蛋白可進行翻譯后加工，例如糖基化修飾等，并可正確折疊。利用真核系統(tǒng)產(chǎn)生的抗原，能夠最大程度的模擬病毒蛋白，用于檢測時的特異性和靈敏性更高。但真核表達系統(tǒng)的表達量低，獲得重組抗原的數(shù)量較少。本實驗利用真核表達系統(tǒng)成功表達了gD蛋白，并利用信號肽設法讓蛋白在細胞的表面表達。蛋白在細胞的表面表達，擬不用純化抗原，直接用細胞制備抗原片，用于病毒血清的檢測。在下一步的實驗中，會獲得gD蛋白的穩(wěn)定表達細胞株，直接用于病毒檢測抗原片的制備，為新型獼猴B病毒檢測方法的建立提供新的方法。

參考文獻：

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[8]肖鏡, 付瑞, 賀爭鳴, 等. 猴B病毒BVgD-多肽ELISA檢測方法的建立 [J]. 實驗動物科學, 2008, 25(2): 20-23.

[9]張文韜, 董罡, 袁菊芳, 等. 猴B病毒囊膜糖蛋白gD的克隆表達及其診斷價值評價 [J]. 中國人獸共患病學報, 2012, 28(4): 363-366

〔修回日期〕2015-05-07

研究報告

glycoprotein D gene and the gD gene expression

WANG Xin1, YI Si-meng1,2，LIU Hui-fang1,2, MA Kai2, FAN Jun-wen2, MA Yu-nan2,

YOU Ying2, SUN Zhao-zeng2

(1. Qingdao Agriculture University, Qingdao 266109, China；

2. Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071)

【Abstract】ObjectiveTo establish an eukaryotic vector of monkey B virus glycoprotein D gene and analyze the expression of gD gene in human embryonic kidney 293T cells. MethodFirst, the protein of monkey B virus glycoprotein D was obtained by gene synthesis. The gene fragments were digested with Pst I and Not I, and ligated to pEGPF-N3. Then, the recombinant plasmid pEGPF-N3-GD was transfected into 293T cells. The expression of gD protein in the cells was detected by Western blot, and the expression localization was investigated using laser scanning confocal microscopy. ResultsThe recombinant plasmid pEGPF-N3 carrying gD gene was successfully constructed, and normally expressed in the 293T cells. ConclusionsGlycoprotein D of monkey B virus is expressed successfully in the 293T cells and the protein is located on the cell surface. It may be useful for the preparation of specific recombinant antigen to the glycoprotein D of monkey B virus on cell surface, and can be also used for preparation of antigen slide for detection of monkey B virus.

【Key words】Monkey B virus; gD protein; Vector construction；Eukaryotic expressing

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.006

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 06-0028-04

[通訊作者]孫兆增(1977-)，男，副研究員，研究方向：實驗動物分子微生物學，E-mail: laxszz@aliyun.com。

[作者簡介]王新 (1973- ) 男，副教授，研究方向：中獸醫(yī)學。

[基金項目]國家自然科學基金項目(31272387)；十二五重大傳染病專項(2011zx09201-031)。