葉慧香， 崔躍原， 宋新元， 馬　娟， 萬　虎， 李建洪*

1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070； 2吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，吉林 長春 130124

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轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米對土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

葉慧香1， 崔躍原1， 宋新元2， 馬娟1， 萬虎1， 李建洪1*

1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，吉林 長春 130124

摘要:【背景】土壤微生物是維持土壤生態(tài)系統(tǒng)中生物活性的重要組成部分，土壤細(xì)菌作為土壤中數(shù)量最豐富、分布最廣泛的微生物類群，其結(jié)構(gòu)多樣性和動(dòng)態(tài)分布對土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義。因此，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的安全性必須考慮轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物對土壤細(xì)菌的影響?！痉椒ā吭诖筇飾l件下，連續(xù)2年以轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和受體對照玉米為研究材料，采用變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)和磷脂脂肪酸(PLFA)研究轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和受體對照玉米不同生育期根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化?！窘Y(jié)果】PLFA分析結(jié)果顯示，2012年，轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和受體對照玉米間微生物總量在拔節(jié)期有顯著性差異,其他時(shí)期無顯著性差異；然而，土壤中細(xì)菌微生物總量和革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌微生物量比值在檢測的4個(gè)時(shí)期均無顯著性差異；其中，革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌比值均大于1。2013年的整個(gè)生育期內(nèi)，轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和受體對照的微生物總量、細(xì)菌微生物量、革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌微生物量比值均無顯著性差異。DGGE結(jié)果顯示，2012年和2013年玉米的4個(gè)生育時(shí)期內(nèi)，玉米根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相對較穩(wěn)定，同一生育期轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和受體對照玉米間無顯著性差異，且根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性均達(dá)到較高水平，與PLFA檢測結(jié)果大體一致?！窘Y(jié)論與意義】2年的數(shù)據(jù)均表明，轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米對土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無顯著性差異，可為轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米安全性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞:磷脂脂肪酸分析； 變性梯度凝膠電泳； 根際； 細(xì)菌總量； 革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌生物量比值

自20世紀(jì)70年代重組DNA技術(shù)建立并于1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因植物以來(Lal & Lal,1991; Zambryske,1983)，轉(zhuǎn)基因作物的開發(fā)和應(yīng)用取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAA)最新報(bào)道，2013年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)1.75億hm2，較2012年增長3%，在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植的18年間，其種植面積增長了100倍(James,2013)。其中轉(zhuǎn)基因玉米種植面積達(dá)5800萬hm2，轉(zhuǎn)Bt玉米種植面積占1/4。隨著轉(zhuǎn)Bt玉米的長期種植，其中的Bt蛋白可通過根系分泌物、秸稈還田、殘茬分解及花粉飄落等方式在土壤中積累和富集，可能影響土壤微生物區(qū)系的組成和結(jié)構(gòu)，改變微生物的多樣性(Fanetal.,2001； Gaughey & Whalon,1992)。研究發(fā)現(xiàn)，Bt蛋白進(jìn)入土壤后，可與土壤粘粒和腐殖酸迅速結(jié)合且不易分離，并可抵抗土壤微生物的降解(Tapp,1994; Tapp & stotzky,1998、1999)。

微生物種類多、生長繁殖快、代謝能力強(qiáng)、對環(huán)境影響敏感、與其他生物具有同一套遺傳密碼，上述特性決定了微生物是環(huán)境中最敏感的指示生物之一(昌艷萍等，2011)，其活性和群落結(jié)構(gòu)的變化能反映土壤生態(tài)系統(tǒng)的質(zhì)量和健康狀況(黎寧等，2006； Knightetal.,1997; Zelles,1999)。因此，研究轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物的影響對轉(zhuǎn)基因作物的安全性具有重要意義。一些學(xué)者提出并研究了轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境釋放后土壤微生物群落的變化(Angle,1994; Jepsonetal.,1994)，F(xiàn)angetal.(2005)通過變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和Biolog分子生物學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt基因玉米顯著影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。Liuetal. (2008)應(yīng)用DGGE和末端限制性片段長度多態(tài)性(Terminal restriction fragment length polymorphism，T-PRLP)技術(shù)，通過3年的田間試驗(yàn),檢測了轉(zhuǎn)Bt基因和非轉(zhuǎn)基因水稻根際細(xì)菌、真菌群落多樣性，結(jié)果表明，水稻生育期顯著影響根際微生物多樣性，但轉(zhuǎn)cry1Ab基因水稻對土壤中細(xì)菌、真菌無顯著影響。劉麗等(2010)通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)等方法研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)抗菌肽D煙草可能抑制病原細(xì)菌及其根圍相關(guān)的微生物的繁殖，但不影響微生物的遺傳多樣性。李長林等(2008)通過PCR、T/A克隆、RFLP等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因棉花對根際土壤微生物多樣性無影響，棉花根際土壤微生物區(qū)系差異主要受生育期影響。

目前，國內(nèi)外研究轉(zhuǎn)Bt玉米對土壤微生物的影響多數(shù)在溫室內(nèi)或人工培養(yǎng)的條件下進(jìn)行，田間研究相對較少，難以真實(shí)反映轉(zhuǎn)Bt玉米與根際微生物間的關(guān)系。本研究通過連續(xù)2年田間試驗(yàn)，以轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和受體對照玉米為研究材料，分析和比較了2種玉米在同1個(gè)生育期內(nèi)以及整個(gè)生育期內(nèi)對土壤細(xì)菌的影響，為研究轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　材料

轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照玉米由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，于2012年和2013年連續(xù)2年種植。

1.2　試驗(yàn)小區(qū)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地設(shè)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院河北省廊坊轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全檢測試驗(yàn)基地?；氐貏萜教梗^(qū)面積225 m2(15 m×15 m)，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)間設(shè)有1 m走道和3 m保護(hù)行。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。常規(guī)耕作管理，整個(gè)生育期內(nèi)不使用殺蟲劑。

1.3　樣品采集

在玉米的播種前期、拔節(jié)期、抽絲期和成熟期分別采集土壤樣品。播種前取地表下15～20 cm土壤；其他各時(shí)期以抖落法取根際土壤(Watrud & Seidler,1998)。每個(gè)小區(qū)采用S型取樣法選取6點(diǎn)，剔除土表雜物，每點(diǎn)分別取土樣約300 g(若因單株的根系抖落法難以取到300 g，可在每點(diǎn)同時(shí)取幾棵植株的混合土壤作為樣本)。取樣后立即分樣放入冰盒中并儲(chǔ)存于實(shí)驗(yàn)室。土樣平均分成2份，一份儲(chǔ)存于4 ℃冰箱用于PCR-DGGE檢測，另一份儲(chǔ)存于-80 ℃用于測定PLFA。

1.4　土壤總DNA的提取

采用Soil DNA Kit試劑盒(Omega公司)，分別稱取混合好的土樣0.5 g，按照操作說明書進(jìn)行提取，土壤DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品質(zhì)量后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5　土壤總DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

采用巢式PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)，第1次PCR所用引物P0(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物P6(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)，片段長度1500 bp，第2次PCR所用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和反向引物518R(5′-ATTACCGCGGCTG5′CTGG-3′)，在正向引物的5′端添加“GC-clamp”(5′-CGCCCGCCGCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCCCGGGGG-3′)(Hareetal.,2005; Thompsonetal.,2002)，片段長度230 bp。50 μL的PCR反應(yīng)體系：0.25 μL Ex Tag polymerase，5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+Plus)，4 μL dNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1)，引物(20 μmol·L-1)各1 μL，第1次PCR所用模板為DNA 1 μL，第2次PCR所用模板為第1次PCR產(chǎn)物1 μL，無菌超純水補(bǔ)足50 μL。PCR采用touch-down擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性1 min，68 ℃退火1 min，依次每個(gè)循環(huán)降1 ℃，72 ℃延伸2 min，共10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共20個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.6　16S rDNA V3區(qū)DGGE檢測

采用Bio-Rad DGGE電泳系統(tǒng)，配制聚丙烯酰胺(37.5∶1)濃度8%、變性劑濃度分別為0%和100%的膠，借助旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣器配制成梯度濃度為40%～60%的膠，并插入梳子，凝膠3～4 h(可在空調(diào)下加熱加速凝膠)，同時(shí)預(yù)熱緩沖液1×TAE(Tris-Ace-tata-EDTA)到60 ℃以上(周小奇等，2007)。將純化后的16S rDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物20 μL點(diǎn)樣，電泳溫度60 ℃，200 V電泳5 min，待樣品進(jìn)入凝膠后60 V電泳16 h。電泳結(jié)束后，凝膠加入固定液(10%乙醇，0.5%冰乙酸)固定15 min，蒸餾水漂洗3次；加入染色液(0.2%硝酸銀，0.1%甲醛)銀染15 min，蒸餾水漂洗3次；加入顯色液(15%氫氧化鈉，0.5%甲醛)顯色10 min并攝像(梁宏偉等，2008)得到DGGE圖譜。

1.7　PLFA分析

取8 g土樣，利用FAMEs法進(jìn)行提取，將含有磷脂的提取液過柱分析，并將得到的磷脂甲酯化處理，以酯化C19∶0為內(nèi)標(biāo)，Agilent6890氣相色譜儀檢測分析，PLFA的鑒定采用Sherlock MIS 4.5系統(tǒng)(Bligh & Dyer,1959; Bossioetal.,1998; Frosteg?rdetal.,2010)。

1.8　數(shù)據(jù)分析

采用Sigmaplot 12.0和 SPSS19.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(LSD法)。DGGE指紋圖譜應(yīng)用Quantity One軟件分析，構(gòu)建聚類樹狀圖。應(yīng)用SAS 18進(jìn)行主成分分析。

2結(jié)果與分析

2.1　玉米根際土壤微生物的磷脂脂肪酸分析

2.1.1玉米根際微生物磷脂脂肪酸含量及組成對2年的玉米根際微生物總磷脂脂肪酸分析表明，2012年共分離了27種碳鏈長度在14~22的PLFAs，轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照根際PLFA總量均呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢，在播前期、抽絲期和成熟期，轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照玉米土壤總微生物量無顯著差異，但在拔節(jié)期顯著低于對照31.56%(圖1A)。2013年共分離出了51種碳鏈長度在14~22的PLFAs，轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照玉米的主峰相似，在整個(gè)生育期內(nèi)，兩者的間根際土壤總PLFA含量變化趨勢與2012年一致，但在拔節(jié)期，兩者無顯著差異，且轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米PLFA含量均高于對照玉米(圖1B)。

2.1.2土壤細(xì)菌PLFA總量分析2012年細(xì)菌微生物量變化趨勢與總微生物量變化趨勢一致，最低值均出現(xiàn)在拔節(jié)期，且拔節(jié)期的轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米細(xì)菌生物量低于對照，但差異不顯著。選取的代表細(xì)菌生物量指標(biāo)：14∶0 iso，15∶1 iso G，15∶0 iso，15∶0 anteiso，15∶00，16∶1 iso G，C16 N alcohol，16∶0 iso，16∶1 ω9c，16∶1 ω7c，16∶1 ω5c，16∶00，iso 17∶1G，17∶0 iso，17∶0 anteiso，17∶1 ω8c，17∶0 cyclo，16∶1 2OH，18∶1 ω5c，18∶00，19∶1(ω8?)alcohol，19∶0 cyclo c1-12,21∶1 ω3c。革蘭氏陽性菌通過PLFA總含量估算：14∶0 iso，15∶1 iso G，15∶0 iso，15∶0 anteiso，16∶1 iso G，16∶0 iso， iso 17∶1G，17∶0 iso，17∶0 anteiso。革蘭氏陰性菌通過以下指標(biāo)估算：C 16N alcohol，16∶1 ω5c，16∶1 ω9c，16∶1 ω7c，17∶1 ω8c，17∶0 cyclo，16∶1 2OH，18∶1 ω5c，19∶1(ω8?) alcohol，19∶0 cyclo c1-12，21∶1 ω3c(Fangetal.,2000; Yuetal.,2009)。在除拔節(jié)期外的整個(gè)生育期內(nèi)，轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米的細(xì)菌生物量高于對照，但無顯著差異(圖2A)。在拔節(jié)期，轉(zhuǎn)cry1Ie基因玉米根際土壤中革蘭氏陽性細(xì)菌的比例較低，在抽絲期，轉(zhuǎn)cry1Ie基因玉米G+/G-比值較高，但差異未達(dá)到顯著水平(圖3A)。2013年轉(zhuǎn)cry1Ie基因玉米和對照根際土壤細(xì)菌生物量以及G+/G-比值見圖2B和圖3B。2013年的細(xì)菌生物量通過12∶00，13∶0 iso，14∶1 iso E，12∶0 3OH，14∶1 ω5c，14∶00，15∶1 iso G，15∶1 anteiso A，5∶0 iso，15∶0 anteiso，15∶00，16∶0 N alcohol，16∶0 iso，16∶0 anteiso，16∶1 ω5c，16∶00，15∶0 iso 3OH，17∶0 iso，17∶0 anteiso，17∶1 ω8c，17∶0 cyclo，17∶00，16∶0 2OH，18∶1 ω5c，18∶00，19∶0 iso，19∶0 cyclo ω8c，18∶1 2OH，20∶1 ω9c，20∶00，16∶1 ω6c，17∶1 iso I，18∶1 ω8c來估算。革蘭氏陽性菌通過以下PLFA總含量估算：12∶00，13∶0 iso，14∶1 iso E，14∶0 iso，16∶0 iso，16∶0 anteiso，16∶00，17∶0 iso，17∶0 anteiso，17∶00，18∶00，19∶0 iso，20∶00，17∶1 iso I。革蘭氏陰性菌通過以下PLFA的總含量估算：12∶0 3OH，14∶1 ω5c，16∶0 N alcohol，16∶1 ω5c，15∶0 iso 3OH，17∶1 ω8c，17∶0 cyclo，16∶0 2OH，18∶1 ω5c，19∶0 cyclo ω8c，18∶1 2OH，20∶1 ω9c，16∶1 ω6c，18∶1 ω6c(Fangetal.,2000; Yuetal.,2009)。2013年玉米的細(xì)菌PLFA總含量和G+/G-比值變化趨勢與2012年變化趨勢相一致，均為先減少后升高再減少，細(xì)菌PLFA總含量在拔節(jié)期最低，G+/G-比值在成熟期最低(圖2B)。在播前期和拔節(jié)期，轉(zhuǎn)cry1Ie基因玉米的比值均小于對照，但在抽絲期和成熟期，轉(zhuǎn)cry1Ie基因玉米的比值高于對照，但二者也無顯著差異(圖3B)。

圖1　2年中轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照對根際土壤磷脂脂肪酸(PLFA)的影響

圖2　2年轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照對根際土壤細(xì)菌微生物量的變化

圖32年轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照對根際土壤革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌動(dòng)態(tài)變化

Fig. 3Temporal variation of soil G+/G- in transgeniccry1Iegene insect-resistant maize and control maize fields in 2012 and 2013

A.2012年；B.2013年。1：播前期；2：拔節(jié)期；3：抽絲期；4：成熟期。

A. 2012； B. 2013. 1: Pre-seed stage; 2: Joint stage; 3: Ladder stage; 4: Mature stage．

2.1.3土壤微生物群落結(jié)構(gòu)2012年P(guān)CA分析結(jié)果表明，與微生物PLFA生物標(biāo)記多樣性相關(guān)的主成分1和主成分2分別解釋變量方差的73.51%和16.96%(圖4)。不同生育期的PLFA在圖中各占不同的空間，表明不同生育期玉米根際土壤微生物群落組成差異較大。同一時(shí)期，轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照分布較集中，說明2種玉米的根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)較相似(圖4)。2013年主成分1解釋變量方差的69.37%，主成分2解釋變量方差的15.84%，播前期玉米的PLFA在圖中與其他3個(gè)時(shí)期相距較遠(yuǎn)，表明播前期玉米根際土壤微生物群落組成與其他3個(gè)時(shí)期相差較大，同一時(shí)期，轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照在圖中分布較集中，說明兩者的根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著差異(圖5)。

圖4　2012年轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照對根際土壤磷脂脂肪酸(PLFA)主成分分析

2.2　玉米根際土壤微生物DGGE分析

圖 52013年轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照對根際土壤磷脂脂肪酸(PLFA)主成分分析

Fig.5The principal component analysis of transgeniccry1Iegene insect-resistant maize and control maize in 2013

BQ:播前期；BJ-T：拔節(jié)期轉(zhuǎn)基因玉米；BJ-N：拔節(jié)期非轉(zhuǎn)基因玉米；CS-T：抽絲期轉(zhuǎn)基因玉米；CS-N：抽絲期非轉(zhuǎn)基因玉米；

CSH-T：成熟期轉(zhuǎn)基因玉米；CSH-N：成熟期非轉(zhuǎn)基因玉米。

BQ: Pre-seed stage; BJ-T: Transgenic maize in joint stage; BJ-N: Non-transgenic maize in joint stage; CS-T： Transgenic maize in ladder stage;

CS-N： Non-transgenic maize in ladder stage; CSH-T： Transgenic maize in mature stage; CSH-N： Non-transgenic maize in mature stage.

16S rDNA V3區(qū)DGGE圖譜顯示了轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照在不同時(shí)期根部土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成(圖6~7)。2012年，播前期二者相似性高達(dá)100%，拔節(jié)期86%，抽絲期83%，成熟期86%(圖6)；2013年，播前期轉(zhuǎn)cry1Ie基因玉米和對照根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性為99%，拔節(jié)期95%，抽絲期和成熟期均高達(dá)96%(圖7)。因此，在同一時(shí)期內(nèi)二者的土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似性較高，在整個(gè)生育期內(nèi)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成比較穩(wěn)定。2年結(jié)果均顯示土壤中細(xì)菌菌群類別豐富，且同一年的玉米整個(gè)生育期內(nèi)所有優(yōu)勢種群均未發(fā)生較大變化。

圖6　2012年轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照DGGE圖譜分析結(jié)果

3討論

土壤微生物是維持土壤生態(tài)系統(tǒng)中生物活性的重要組成部分(Wardleetal.,2004)，土壤細(xì)菌作為土壤中數(shù)量最豐富、分布最廣泛的微生物類群，其結(jié)構(gòu)多樣性和動(dòng)態(tài)分布對土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義。因此，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的安全性必須考慮轉(zhuǎn)基因作物對土壤細(xì)菌的影響。

在本研究中，2012年，除了在拔節(jié)期轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米土壤PLFA總量較對照玉米顯著降低以外，在其他同一時(shí)期二者均無顯著差異。出現(xiàn)差異的可能原因是在第1年玉米種植時(shí)，有些植物殘?bào)w進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)，在拔節(jié)期造成土壤微生物群體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一些變化，造成二者之間出現(xiàn)差異，還有待進(jìn)一步深入研究。細(xì)菌微生物量以及G+/G-比值在同一生育期內(nèi)，轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照玉米均未出現(xiàn)顯著差異。2013年的研究結(jié)果表明，同一時(shí)期內(nèi)，轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照玉米的總PLFA量、細(xì)菌微生物量以及G+/G-比值均無顯著差異。且2年的結(jié)果均表明，在不同生育期內(nèi)玉米根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異也不顯著。Kaietal.(2005)利用PLFA技術(shù)，以轉(zhuǎn)Bt基因玉米和轉(zhuǎn)Bt基因馬鈴薯為材料進(jìn)行研究，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因作物提高了細(xì)菌PLFA含量，但二者之間差異不顯著，G+/G-比值也無顯著差異。Kimetal.(2008)研究2個(gè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻品系Iksan 483 和 Milyang 204對根部土壤細(xì)菌群落影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻根部細(xì)菌群落也無明顯差異。劉微等(2011)研究表明，各個(gè)生育期，轉(zhuǎn)Bt基因水稻的種植沒有造成根際土壤細(xì)菌、真菌、放線菌磷脂脂肪酸含量發(fā)生顯著改變。

圖7　2013年轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照玉米DGGE圖譜分析結(jié)果

關(guān)于PLFA方法也存在一些爭議，如環(huán)境溫度以及營養(yǎng)元素可能會(huì)影響結(jié)果，另外土壤中的植物組織也可能含有與微生物相同的脂肪酸(張洪勛等，2003)。本文同時(shí)采用PCR-DGGE技術(shù)來探討土壤細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)以揭示轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米對根際微生物的影響。2年的DGGE結(jié)果均顯示，在同一玉米生育期，轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米和對照玉米細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性均很高。鄒雨坤等(2011)和劉玲等(2012)利用DGGE技術(shù)分析轉(zhuǎn)Bt基因玉米對土壤細(xì)菌群落的影響，結(jié)果無顯著差異；Liuetal.(2008)用PCR-DGGE在分析轉(zhuǎn)Bt基因水稻對酶活性和微生物區(qū)系組成影響時(shí)指出，轉(zhuǎn)Bt基因水稻與親本之間無顯著性差異，不同生育期土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化也較穩(wěn)定。本研究以PLFA法和DGGE法分析了轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，與PLFA研究結(jié)果基本一致，2種方法均表明轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)無明顯影響。

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(責(zé)任編輯:郭瑩)

The effect of transgenic maize withcry1Iegene on rhizosphere bacteria community structure

Hui-xiang YE1, Yue-yuan CUI1, Xin-yuan SONG2, Juan MA1, Hu WAN1, Jian-hong LI1*

1CollegeofPlantScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei430070,China;

2NationalCenterforEnvironmentalSafetyInspectionofTransgenicPlants,MinistryofAgriculture,

JilinAcademyofAgriculturalSciences,Changchun,Jilin130124,China

Abstract:【Background】 Soil microbes are an important part for maintaining biological activities. Soil bacteria are diverse, widely distributed and their structural diversity and dynamic distribution are important for the stability of the lithosphere. In this study, the safety of genetically modified crops on soil bacteria was examined. 【Method】 The community structure of the rhizosphere in fields of transgenic cry1Ie maize and its parental non-Bt maize (the control) were measured at different growth stages. This was assessed using culture-independent technique polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) and Phospholipids fatty acid (PLFA) assays. 【Result】 PLFA analysis showed that the bacteria biomass and G+/G- of transgenic cry1Ie maize and maize receptors control of 2012 had no significant difference at the same growth stage, but significant differences were detected for microbial biomass at different following stages. The values of G+/G- were greater than one, suggesting that at each growth stage, microbial biomass of Gram-positive bacteria was greater than Gram-negative bacteria. During the entire growing period, insect-resistant corn with cry1Ie receptor gene control was not a significant different than control corn. Tt was no significant difference in 2013 in the total amount of microbial and bacterial biomass and the ratio of Gram-positive bacteria and gram-negative bacteria between both corn types. The cluster analysis results showed no remarkable difference in DGGE profile of bacteria at the same growth stage. Corn rhizosphere bacterial community structure was relatively stable and similar in both 2012 and 2013. 【Conclusion and significance】 Two years of data showed that insect-resistant cry1Ie transgenic maize had no significant effects on soil bacterial community structure. The study can provide a theoretical basis to evaluate the safety of transgenic maize with cry1Ie gene.

Key words:phospholipids fatty acid assay; polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis; rhizosphere; soil bacterial； the value of G+/G-

DOI:10.3969/j.issn.2095-1787.2015.01.012

通訊作者*(Author for correspondence), E-mail: XL6479@163.com

作者簡介:張雁, 女, 碩士研究生。 研究方向： 植物檢疫病害。 E-mail: 568779683@qq.com

基金項(xiàng)目:國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201310091)

收稿日期(Received)： 2014-12-14接受日期(Accepted)： 2015-01-13