莊金秋，梅建國，劉吉山，姚春陽

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

綜述與專論

牛支原體實驗室檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，劉吉山，姚春陽

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

隨著規(guī)?；B(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展，牛支原體已經(jīng)成為危害養(yǎng)牛業(yè)的一種重要致病性支原體，可導致牛肺炎、乳腺炎、關節(jié)炎等多種疾病，造成巨大的經(jīng)濟損失。文章綜述了牛支原體的實驗室檢測方法研究進展，以期為我國牛支原體病的防治提供參考。

牛支原體；檢測；研究進展

牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）屬支原體科支原體屬，是一種介于細菌和病毒之間的無細胞壁的原核微生物。M.bovis可引起犢牛肺炎、乳腺炎、關節(jié)炎、角膜結膜炎、耳炎、生殖道炎甚至流產(chǎn)與不孕等多種疾病。牛支原體是繼引起被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類動物疫病——牛傳染性胸膜肺炎的絲狀支原體絲狀亞種SC型后對牛致病力最強的支原體，二者具有相似的臨床癥狀和病理剖檢變化，不易鑒別診斷。1961年美國首次從一例患乳腺炎的牛乳中分離出M.bovis［1］。1976年美國首次報道了M.bovis引起的肺炎。我國于1983年由黎濟申等從患乳腺炎的牛乳中首次分離到了該病原［2］，辛九慶等［3］于2008年從患肺炎的犢牛肺臟中首次分離到該病原。M.bovis是危害犢牛的重要致病性病原體，具有較高的感染率，患支原體肺炎的犢牛死亡率較高，經(jīng)治療后癥狀緩解的牛也一般發(fā)育遲緩，甚至成為廢牛，嚴重影響牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量。M.bovis病呈世界性分布，近年來MbAD已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，由于M.bovis感染后可明顯增加其他病原的繼發(fā)感染，給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。M.bovis感染后病牛無特殊癥狀，因此很難對該病進行感官判斷，確診需借助實驗室診斷。本文綜述了近年來M.bovis感染最新實驗室檢測方法研究進展，以期對疾病的預防控制提供參考。

1 支原體分離鑒定

支原體分離鑒定方法應嚴格按照無菌操作規(guī)程，將患病動物的組織病料接種于培養(yǎng)基中，支原體培養(yǎng)營養(yǎng)需求較高，通常要在培養(yǎng)基中加入10%～20%馬血清，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。在類胸膜肺炎微生物（pleuropneumonia like organism，PPLO）固體培養(yǎng)基中進行分離培養(yǎng)時，在光學顯微鏡下，菌落呈現(xiàn)典型的“煎蛋狀”形態(tài)，邊緣整齊，表面光滑，中間厚周邊薄的菌膜斑點。如若7 d未發(fā)現(xiàn)生長跡象，可判斷為陰性。初步鑒定后，在含酚紅的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基顏色是否由紅變黃，且稍渾濁，而后根據(jù)配套的生化反應進行鑒定。常用液體培養(yǎng)基包括 Hayfiick、Edward、Frey、MEM-KMZ、SP-4等。M.bovis對外界環(huán)境要求較高，采集病料如未能及時送往實驗室極易導致病原發(fā)生死亡。一般病料需冷藏運輸，運輸時間不要超24 h，也可將其凍存于運輸培養(yǎng)基中運輸。對于病料的采集，一般下呼吸道比上呼吸道分離出病原的概率大。雖然該方法可以確診是否有M.bovis的感染，但是其分離難度大，分離周期長，不能作為快速診斷M.bovis感染的有效方法來使用。

2 血清學方法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

血清學方法是檢測M.bovis感染的可靠方法，尤其對于經(jīng)抗生素治療或一些慢性病例，血清抗體檢測方法比病原培養(yǎng)方法更敏感。利用全菌抗原或重組抗原建立的間接ELISA方法是檢測血清抗體的首選方法，其應用最為廣泛。用處理過的M.bovis全菌蛋白作為包被抗原的間接ELISA方法不僅能夠檢測血清抗體，還可以檢測患有乳腺炎奶牛的乳清抗體，此方法被廣泛應用于M.bovis感染的流行病學調(diào)查，但是由于建立該方法的抗原為全菌蛋白，其特異性有待提高?；诖?，Brank等［4］建立了以M.bovis的VSP重組蛋白作為包被抗原的間接ELISA方法，Robino等［5］建立了以M.bovis的膜脂蛋白P48作為包被抗原的間接ELISA方法用以檢測對應抗體。Fu等［6］利用P48重組蛋白作為包被抗原，其相應的單克隆抗體用HRP進行標記，建立了直接競爭ELISA方法檢測M.bovis抗體，與其他兩種商品化ELISA試劑盒比較發(fā)現(xiàn)，該方法特異性好，敏感性高。以P48蛋白作為包被抗原的ELISA方法能檢測M.bovis的所有分離株，但是不與感染牛的其他6種支原體反應，在檢測M.bovis感染方面有很好的應用前景。Wawegama等［7］鑒別出一種可以具有脂肪酶活性的膜蛋白（mycoplasma immunogenic lipase A，MilA），該蛋白氨基末端與M.bovis抗體有很強的免疫反應，利用大腸桿菌誘導表達該段蛋白建立了間接ELISA方法，敏感性達到92.86%，特異性高達98.7%。金云云等［8］以M.bovis全菌蛋白經(jīng)超聲波裂解后的裂解物作為包被用抗原，建立了檢測M.bovis血清抗體的間接ELISA方法。Han等［9］基于全菌蛋白建立了一種間接ELISA方法，特異性好，而且可以區(qū)分出感染牛和免疫牛，從而可以判斷牛感染程度高低、疫苗有效與否。國外商品化的檢測M.bovis抗體的ELISA試劑盒有瑞士、加拿大和比利時等國家研制的試劑盒。國內(nèi)劉洋等［10］將純化后的P28重組蛋白作為抗原建立了檢測M.bovis血清抗體的間接ELISA方法并組裝成試劑盒，填補了國內(nèi)ELISA試劑盒的空白，該試劑盒具有良好的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，能在一次反應中對M.bovis和MmmSC作鑒別診斷，他同時應用3種試劑盒對38份陽性樣品（自然感染19份，人工感染18份）和37份陰性樣品進行檢測。結果表明自制的HVRI試劑盒與加拿大商品化試劑盒Kit 1的檢測結果符合率高達92%，各種技術指標相當，可作為進口試劑盒的替代品用于M.bovis的臨床診斷與流行病學調(diào)查。

2.2 間接血凝試驗（IHA）

IHA是一種經(jīng)典的免疫學診斷技術，因其操作簡單、穩(wěn)定、成本低，具有較高的敏感性和特異性，且對試驗條件要求低，可被廣泛應用于獸醫(yī)實驗室檢測、田間血清學調(diào)查和基層獸醫(yī)部門的輔助診斷。簡瑩娜等［11］以純化的P48重組蛋白致敏醛化-鞣酸化的綿羊紅細胞并對其工藝進行優(yōu)化，建立了檢測M.bovis抗體的IHA方法。該方法與國外商品化的ELISA試劑盒比較，平均符合率為96.15%。對833份田間血清和1 084份乳清進行檢測，陽性率分別為15.37%和19.56%。該方法敏感性高、特異性強和重復性好，可用于M.bovis抗體水平監(jiān)測、牛支原體病的輔助診斷和流行病學調(diào)查。

2.3 膠體金免疫層析試紙條

簡瑩娜［12］利用牛支原體P48重組蛋白，建立了檢測M.bovis抗體的膠體金免疫層析試紙條。應用該試紙條檢測臨床血清200份，乳清108份，陽性率分別為21.50%和17.59%，與IHA方法相比符合率為96.53%。表明該試紙條敏感、特異、快速，適合于M.bovis抗體的快速檢測。

2.4 免疫組化技術

免疫組化技術是一門將免疫學與組織化學相結合的技術，在組織細胞原位通過抗原-抗體特異性結合反應和組織化學顯色反應，借助可見的標記物對相應抗原或抗體進行定位、定性和定量檢測，不僅能準確地判斷是否有病原感染，而且還能清晰地反映病原在組織器官和細胞中的定位及分布。該方法操作簡便、不需要專門的儀器設備，適合于基層臨床的快速診斷，并且對于研究病原在機體內(nèi)的致病機制及分布規(guī)律也有一定的輔助作用。Adegboye等［13］基于單克隆抗體建立了免疫組化方法檢測犢牛肺組織中的M.bovis，與殊異支原體陽性、牛鼻支原體陽性以及牛支原體陰性的牛組織切片等沒有交叉反應，且直觀反映出病原的分布。Haines等［14］建立了M.bovis免疫組化技術，對牛場M.bovis感染所致的急、慢性呼吸道疾病、肺炎、乳腺炎等進行了病原體檢測，同時，亦提示病原體數(shù)量、定居部位與病理損傷程度、致病機理等之間可能存在的聯(lián)系。Khodakaram-Tafti等［15］采用免疫組化方法進行M.bovis的診斷，不僅能對福爾馬林固定的組織進行M.bovis檢測，還能清楚地顯示出M.bovis在病灶內(nèi)的具體位置，該方法能夠定位抗原、直觀地觀察病變組織的病理變化以及M.bovis侵襲機體后的分布情況。金云云等［16］以雞抗M.bovis IgY為一抗，以HRP標記的羊抗雞IgG為二抗建立了檢測M.bovis的間接免疫組化法。該方法可用于檢測臨床病例組織樣本及培養(yǎng)物中的M.bovis，為探究該病原在機體內(nèi)的定位、動態(tài)分布規(guī)律及致病機理提供了手段。

2.5 其他血清學方法

其他血清學檢測方法如應用兔源高免疫血清鑒定M.bovis的抗體檢測方法包括生長抑制試驗（GI）、生物膜形成抑制試驗（FI）、熒光抗體試驗（FA）和新陳代謝抑制試驗（MI）等。由于這些試驗無商品化抗血清，需在實驗室自行制備，因此操作時較為費時費力。

3 分子生物學方法

3.1 PCR技術

由于牛在養(yǎng)殖場環(huán)境中停留2～4周后都存在可檢測滴度的M.bovis抗體，所以血清學檢測方法不能對牛肺炎病例是否由M.bovis引起進行準確的診斷。PCR檢測技術相對快捷方便，而且靈敏度高，已被廣泛應用于M.bovis的實驗室檢測。早期Hotzel等［17］、Ayling等［18］利用PCR方法擴增16SrRNA用來檢測M.bovis的感染，但是由于M.bovis與無乳支原體（Mycoplasma agalactiae，M. agalactiae）的16S rRNA同源性高達99.8%，在不結合其他方法的情況下無法區(qū)分這兩種病原的感染。于是Johansson等［19］通過16SrRNA的PCR和酶切系統(tǒng)來鑒別這兩種支原體。Subramaniam等［20］選取了DNA修復基因uvrC作為靶基因進行特異性擴增，可以直接應用于臨床患病牛的病原學檢測。Pinnow等［21］建立了套式PCR的方法，能夠快速、準確地鑒定是否由M.bovis引起的乳腺炎。Bashiruddin等［22］建立了ATP結合蛋白oppD/F基因作為靶基因的PCR方法。Foddai［23］等根據(jù)M.bovis的P81基因，設計建立了多重PCR和PCR-RFLP方法，能夠在一次反應中對M.bovis和M.agalactiae作鑒別診斷。我國從2008年開始對M.bovis進行深入研究，P81蛋白是M.bovis和M.agalactiae共有的蛋白，但兩者的同源性僅為67%。李媛等［24］根據(jù)P81基因引物，建立了PCR方法。該方法可以從人工感染牛的鼻拭子和臨床發(fā)病牛肺中擴增出目的片段，與分離培養(yǎng)結果完全符合，為國內(nèi)首次建立的敏感、特異、快速的牛支原體PCR檢測方法。同年利用oppD/F為靶基因，設計2對引物，建立了套式PCR檢測方法，成功地鑒別了M.bovis和M.agalactiae。李彥芹［25］利用通用引物擴增16SrRNA，建立了能夠快速鑒別診斷MmmSC、M.bovis、M.agalactiae和綿羊肺炎支原體的多重PCR方法，可以對臨床病例中懷疑支原體感染的病料進行病原診斷。劉洋等［26］建立了可以同時鑒別檢測M.bovis和MmmSC的雙重PCR方法，為我國無牛肺疫認證以及M.bovis相關疾病診斷提供技術支持。李大偉等［27］也建立了一種可一次性區(qū)分上述3種支原體的三重PCR方法，用于臨床診斷和流行病學調(diào)查。胡國明［28］根據(jù)牛支原體P48基因設計引物，建立了M.bovis與M.agalactiae、MmmSC、滑液支原體、雞毒支原體等病原的PCR鑒別診斷方法，對甘肅蘭州、臨洮、武威等地的臨床病料進行檢測，具有很高的特異性和敏感性，對M.bovis感染臨床快速、準確地診斷具有較高的實用價值。

3.2 熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR技術也被用于M.bovis檢測的研究。Cai等［29］應用雜交探針和退火溫度建立擴增16S rRNA基因序列的的實時定量PCR方法，檢測奶牛牛乳以及肺組織中的M.bovis，在檢測牛乳時其敏感性達100%，檢測肺組織時其敏感性達96.6%。Sachse等［30］針對OppD基因，設計了實時定量PCR引物及探針，在患乳腺炎及呼吸道疾病的病牛中，能夠靈敏特異地鑒別出M.bovis，檢測限能夠達到100 cfu/mL。Rossetti等［31］根據(jù)uvrC基因設計引物，建立實時定量PCR方法，該方法不需要處理牛乳及組織樣品獲取純化的DNA，可直接用于實時定量PCR檢測，具有良好的特異性高度敏感性，方便用于M.bovis的檢測。

3.3 環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術

LAMP方法具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異、經(jīng)濟等特點，適于基層實驗室監(jiān)測的廣泛使用。Saito等［32］利用LAMP對肺炎支原體進行檢測，相同時間內(nèi)LAMP檢測法的靈敏度遠高于實時定量PCR法。在對70例患者及25例正常人咽試紙檢測中陽性率100%，無假陽性。Churchward等［33］同時用競爭性ELISA、套式PCR及LAMP對絲狀支原體進行診斷，結果顯示，LAMP法的敏感性遠高于競爭性ELISA和套式PCR。國內(nèi)白智迪［34］、侯軒等［35］先后根據(jù)M.bovis的uvrC基因設計引物，建立了LAMP方法，敏感性較PCR方法高100倍。在對167個臨床鼻拭子樣本的檢測中，LAMP方法檢測結果陽性率（26.95%）高于PCR方法檢測出陽性率（19.16%）。金云云等［36］根據(jù)P81基因設計引物建立了LAMP方法，最低檢出限為1.1 ng/L。LAMP方法方便快速，成本低廉，可進行大范圍推廣使用。

3.4 雙向電泳技術

陳維等［37］成功建立了M.bovis蛋白質(zhì)組學雙向電泳技術，由于國際上目前尚無M.bovis蛋白組學的相關報道，所以該方法的建立，可以鑒定出相應的致病性蛋白，為M.bovis致病機理的研究提供蛋白質(zhì)組信息。

4 小結

隨著養(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展，牛支原體病的流行范圍越來越廣，發(fā)生頻率也越來越高，嚴重威脅了我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。現(xiàn)階段國內(nèi)外對該病原的研究尚不透徹，特別是對牛支原體疫苗及其遺傳穩(wěn)定性的研究幾乎處于零階段，加之我國對于本病的研究起步較晚，并且國際上尚無公認的特異性診斷方法，以及目前對于該病致病機制的研究尚未達成共識，從而為該病的預防控制帶來了不便。因此建立快速、準確的檢測方法，開發(fā)新型疫苗等防控產(chǎn)品，是控制該病發(fā)生的基礎和關鍵，具有十分重要的意義。上述M.bovis的各種檢測方法各有優(yōu)點和實用性，實際中需根據(jù)不同的場合、條件等選擇使用其中的一種或者多種方法。隨著人們對M.bovis的深入研究，相信現(xiàn)有的檢測方法將不斷得到改進或者新的檢測方法將很快研制出來，以使其檢測技術更加簡便化、快速化和準確化。

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Research Progress in the Detection Methods of the Mycoplasma Bovis

ZhuangJinqiu，Mei Jianguo，Liu Jishan，et al
（Binzhou AcademyofAnimal Science&VeterinaryMedicine，Binzhou 256600，Shandong，China）

With the development of cattle industry，Mycoplasma bovis has became an important pathogen to damage the breeding.It would cause pneumonia，mastitis，arthritis，et al.This paper summarized the research progress in the detection of the Mycoplasma bovis so as to provide

for prevention and control of Mycoplasma bovis infection in China.

Mycoplasma bovis；detection；research progress

S823

A

2095-3887（2016）05-0058-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.05.016

2016-07-22

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-09-12）作者簡介：莊金秋（1978-），女，副研究員，碩士，主要從事細胞培養(yǎng)和動物用病毒疫苗研制。