張菶，孫曉偉，鄒偉*，孫夢娟

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

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針刺對腦卒中后神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響的研究進(jìn)展

張菶1,2，孫曉偉2，鄒偉2*，孫夢娟1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

通過在中國知網(wǎng)、PubMed數(shù)據(jù)庫等網(wǎng)站輸入腦卒中、神經(jīng)干細(xì)胞和針刺等關(guān)鍵詞查找相關(guān)文獻(xiàn)，對近年有關(guān)神經(jīng)干細(xì)胞的研究進(jìn)展及針刺對腦卒中后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響的文章進(jìn)行綜述。認(rèn)為針刺確實(shí)可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，并能對受損神經(jīng)組織進(jìn)行修復(fù)，但其中的機(jī)制仍有待研究。

腦卒中；神經(jīng)干細(xì)胞；針刺

腦卒中按病理分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，二者都可引起腦局部血液循環(huán)障礙，以致該部位腦組織供血受累而出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀和體征[1]。近年發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cell，NSC)對腦卒中后受損神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)源性修復(fù)起重要作用。有實(shí)驗(yàn)表明，腦卒中發(fā)病可誘導(dǎo)腦組織內(nèi)NSC增殖，但腦卒中所誘導(dǎo)NSC增殖的數(shù)量和速度不足以彌補(bǔ)其導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死的數(shù)量和速度[2]。針刺作為一種傳統(tǒng)療法，在治療腦卒中方面起到積極作用，如在減輕炎癥反應(yīng)、保護(hù)血腦屏障、抑制凋亡等方面均有很好療效。已有研究發(fā)現(xiàn)針刺可促進(jìn)腦卒中后NSC增殖。本文通過綜述針刺對NSC的作用，從而為腦卒中的治療提供新思路。

1 NSC研究進(jìn)展

1.1 NSC發(fā)現(xiàn)

神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞是構(gòu)成中樞神經(jīng)的主要細(xì)胞，都由NSC分化而來。起初認(rèn)為神經(jīng)元增殖都發(fā)生在胚胎期，出生后停止，成年一旦神經(jīng)元受損，只能靠膠質(zhì)細(xì)胞增殖來彌補(bǔ)。后來發(fā)現(xiàn)在成年動(dòng)物中中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也有新生神經(jīng)元產(chǎn)生，這也使人們對神經(jīng)元不能再生的觀點(diǎn)產(chǎn)生懷疑。而這些新生細(xì)胞又從何而來？1992年，Reynolds等[3]終于在成年小鼠紋狀體內(nèi)分離出了能夠自我復(fù)制且能分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的NSC。1997年，McKay等[4]又對NSC的概念做了高度概括，即NSC是一類具有增殖能力且能分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一類細(xì)胞群。

1.2 NSC分布、來源

NSC不僅在胚胎期哺乳動(dòng)物腦組織的大部分區(qū)域，如端腦、小腦、海馬、嗅球及腦室中大量存在，成年后，仍有少量殘存于海馬及側(cè)腦室。正常情況下，NSC在成體腦組織內(nèi)多處于靜止?fàn)顟B(tài)，它們僅有少量定向遷移并分化到特定區(qū)域，而在諸如腦卒中等腦損傷后，NSC快速增殖，并不斷向損傷部位遷移、分化，以對該部位進(jìn)行修復(fù)，但單純通過腦損傷刺激調(diào)動(dòng)NSC是不夠的。

神經(jīng)再生作為獲取NSC和神經(jīng)細(xì)胞的重要手段，已成為近年研究熱點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cell，ESC)作為具有多潛能分化特點(diǎn)的全能干細(xì)胞，是人們獲取NSC的最初辦法。80年代初，Evans等[5]首先從小鼠囊胚內(nèi)獲得ESC。而后為了誘導(dǎo)ESC向NSC分化，Bain等[6]將ESC用維甲酸和生長因子處理來獲得NSC，但因維甲酸致畸作用等原因，該方法并不適用于臨床。若能直接提取哺乳動(dòng)物神經(jīng)組織內(nèi)的NSC并大量擴(kuò)增，也是獲取NSC的好選擇。有人試圖在發(fā)育的胎兒和成體腦內(nèi)獲得NSC，但此方法難度大，而且涉及倫理問題也飽受非議。隨著干細(xì)胞研究深入，人們不斷將神經(jīng)干細(xì)胞譜系之外的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)成NSC。目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道骨髓、脂肪等來源的多能干細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)誘導(dǎo)，有分化成NSC的潛能。這些組織在體內(nèi)含量多，取材簡單，還可避免倫理問題，故已成為NSC來源的新選擇。如今獲取NSC的方法不斷更新，2007年，日本學(xué)者[7]將4種與細(xì)胞多能性相關(guān)的基因組合并導(dǎo)入動(dòng)物成纖維細(xì)胞內(nèi)，獲得了iPSC(Induced Pluripotent Stem Cell)，該細(xì)胞許多特性與ESC相似，但其誘導(dǎo)能力較ESC低，且植入體內(nèi)還會(huì)激活癌基因。既然人們最終目的是想通過刺激NSC來獲得神經(jīng)細(xì)胞，是否可越過NSC的環(huán)節(jié)直接得到它？成體細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)換為這一設(shè)想提供可能，該技術(shù)分為直接轉(zhuǎn)分化和間接轉(zhuǎn)化。前者是將特定轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)進(jìn)某成體細(xì)胞，直接將其變?yōu)榱硪环N成體細(xì)胞，目前膠質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞都能通過這一技術(shù)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元；后者是將某種成體細(xì)胞(非神經(jīng)細(xì)胞)先去分化成NSC，再使其分化成神經(jīng)元[8]。二者可解決NSC獲取困難的問題。

1.3 NSC增殖、遷移、分化

NSC的增殖、遷移和分化是一連續(xù)過程。它的分裂方式有兩種：對稱分裂和不對稱分裂。前者是一個(gè)NSC對稱分裂成兩個(gè)相同的NSC，該分裂方式可保證NSC的不斷供給；后者是一個(gè)NSC通過不對稱分裂，變成一個(gè)NSC和一個(gè)前體細(xì)胞，不同種類的前體細(xì)胞可繼續(xù)分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。成體NSC主要存在于海馬及側(cè)腦室下區(qū)，正常情況下，這些區(qū)域的NSC可少量從各自增殖區(qū)向附近靶組織定向遷移、分化，從而形成海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下區(qū)-粒細(xì)胞層系統(tǒng)和腦室下區(qū)-頭側(cè)突起-嗅球系統(tǒng)。但腦卒中后，NSC會(huì)大量向損傷部位遷移，并分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，對損傷部位進(jìn)行修復(fù)。而且這一過程還需要多種調(diào)節(jié)因子及信號通路的參與。

1.4 NSC鑒定

NSC會(huì)表達(dá)一些特異蛋白作為檢測自身的主要指標(biāo)，目前檢測出的蛋白主要有巢蛋白(Nestin)、Musashi-1和SOX-1等。需指出，上述蛋白對于NSC只是相對特異，但因它們在NSC內(nèi)可高表達(dá)，對NSC有高度選擇性，因此仍可將它們作為NSC的主要標(biāo)志物。拿巢蛋白為例，它最早是由Lendahl等發(fā)現(xiàn)的、主要分布于神經(jīng)上皮干細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一種蛋白。NSC內(nèi)都有巢蛋白表達(dá)，而隨著NSC向目的區(qū)域遷移并逐漸分化成熟，其表達(dá)也逐漸下降，直至消失，因此可以說巢蛋白是鑒定NSC的主要標(biāo)志之一。但巢蛋白在NSC內(nèi)大量表達(dá)同時(shí)，也會(huì)在神經(jīng)組織的其他種類細(xì)胞中[9]，甚至在心臟、胰腺等非神經(jīng)組織中檢測到它的存在[10]，所以巢蛋白并非是NSC的特異蛋白，只能說它對NSC有高度選擇性[11]。Musashi-1作為一種RNA結(jié)合蛋白，可特異性結(jié)合m-Numb mRNA并抑制其轉(zhuǎn)錄，m-Numb是Notch通路抑制劑，當(dāng)Musashi-1將m-Numb抑制后，通路即被激活，維持NSC增殖[12]?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)Musashi-1在NSC和神經(jīng)前體細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，同時(shí)它在成體動(dòng)物消化道及乳腺的表皮干細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá)[13]。除上述外，一些轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞表面黏附因子也可作為鑒定NSC的標(biāo)志蛋白。

BrdU(5-Bromo-2-deoxyuridine)作為一種細(xì)胞增殖標(biāo)記物，可標(biāo)記增殖的NSC。大概機(jī)制是BrdU可將NSC內(nèi)DNA的胸腺嘧啶(T堿基)替換出來，再將自己重新整合到DNA內(nèi)。當(dāng)NSC增殖時(shí)，其子代細(xì)胞的DNA也含BrdU[14]。此時(shí)即可通過免疫熒光技術(shù)，用BrdU一抗和相應(yīng)熒光二抗將增殖的NSC標(biāo)記出來。

2 針刺對腦卒中后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NSC表達(dá)的作用

針刺作為一種傳統(tǒng)中醫(yī)療法，在治療腦卒中方面越來越受到重視。在干細(xì)胞技術(shù)不斷突破的今天，人們同時(shí)也注意到針刺對神經(jīng)再生的作用。不同于體外擴(kuò)增，針刺可內(nèi)源性刺激NSC增殖，對人體幾乎無創(chuàng)傷和毒副作用。所以多項(xiàng)研究都圍繞針刺與NSC增殖方向展開。

2.1 針刺頭穴對腦卒中NSC表達(dá)作用

中醫(yī)認(rèn)為[15]，腦為髓海，為元陽精氣所聚，腦與人的神志活動(dòng)以及肢體活動(dòng)密不可分。若腦部病變，勢必使髓海失充，臟腑經(jīng)脈失養(yǎng)，出現(xiàn)神志和肢體活動(dòng)異常。而針刺頭穴可振奮陽氣、填充髓海，使臟腑經(jīng)脈得以滋養(yǎng)，從而改善神志異常和肢體不利的癥狀。現(xiàn)代研究表明，針刺頭穴可能通過激活某些促進(jìn)細(xì)胞增殖的通路來發(fā)揮激活NSC的作用。同時(shí)，針刺頭穴還可抑制腦卒中后腦組織內(nèi)水腫、血腫及炎癥的形成，同時(shí)也可改善腦部電生理，這為NSC增殖提供良好環(huán)境。

李丹等[16]針刺“百會(huì)”透“曲鬢”穴觀察其對腦出血大鼠巢蛋白表達(dá)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組和針刺組Nestin蛋白都在6 h有表達(dá)，2 d達(dá)高峰，3 d、7 d逐漸下降，而且針刺組各時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)較同時(shí)間點(diǎn)模型組顯著升高。即使3 d、7 d針刺組陽性細(xì)胞出現(xiàn)下降，但也明顯高于同時(shí)間點(diǎn)模型組。說明針刺頭穴可以對腦卒中后NSC表達(dá)起積極作用。胡科等[17]為研究針刺對腦缺血后大鼠室管膜下區(qū)NSC表達(dá)的影響，將實(shí)驗(yàn)分成模型組、康復(fù)訓(xùn)練組和針刺加康復(fù)訓(xùn)練組。其中，針刺取百會(huì)及其左右各旁開4 mm的部位行針。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針刺加康復(fù)訓(xùn)練組的新生NSC在7 d、14 d、21 d相較同時(shí)間點(diǎn)的另外兩組有顯著提高，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，吳洪陽等[18]還用針刺百會(huì)、前頂、率谷、懸厘等頭穴在腦缺血大鼠齒狀回觀察7 d時(shí)間點(diǎn)巢蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)針刺組較正常組、假手術(shù)組和模型組相比Nestin陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)最高。

2.2 針刺陽明經(jīng)穴對腦卒中NSC表達(dá)作用

中風(fēng)發(fā)病久臥可致肌肉筋脈痿廢失用，陽明乃五臟六腑之海，針刺陽明經(jīng)穴可潤宗筋、利關(guān)節(jié)，故“治痿獨(dú)取陽明”[19]。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，針刺陽明經(jīng)穴不但可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，同時(shí)也激活腦內(nèi)NSC表達(dá)。

陶靜等[20]為研究針刺對腦缺血再灌注大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)影響，將實(shí)驗(yàn)分為模型組、針刺組、康復(fù)訓(xùn)練組和康復(fù)訓(xùn)練加針刺組。選穴為患側(cè)曲池、足三里。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4組新生NSC均在7 d達(dá)高峰，隨后逐漸下降，其中針刺組與同時(shí)間點(diǎn)模型組相比陽性細(xì)胞數(shù)顯著升高。高劍峰等[21]也試圖通過針刺肩髃、髀關(guān)、足三里等陽明經(jīng)穴激活腦缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穴位治療組在1、3、7、14、21 d五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的新生細(xì)胞表達(dá)數(shù)比同時(shí)間點(diǎn)模型組和非穴位組都高，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 針刺任督二脈經(jīng)穴對腦卒中NSC表達(dá)作用

任督二脈與腦之間有著密不可分的關(guān)系。首先，任督二脈中，任脈主陰，督脈主陽，二者循環(huán)往復(fù)，維持著陰陽平衡。而且二者都循行于腦[22]。因此腦的生理活動(dòng)有賴于任督二脈的正常運(yùn)行。

楊振等[23]為研究刺督調(diào)神法對MCAO大鼠NSC增殖影響，將動(dòng)物分為模型組、藥物組和針刺組，其中針刺組取百會(huì)、風(fēng)府、神庭、水溝。各組大鼠行相應(yīng)處理，在固定療程后處死，且處死前均注射BrdU以標(biāo)記增殖細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺組BrdU/Nestin雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)在療后明顯高于療前，其結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且針刺組療后BrdU/Nestin雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)也較其他兩組治療后相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證明針刺督脈對NSC表達(dá)有促進(jìn)作用。羅丁等[24]觀察針刺人中穴對腦缺血大鼠NSC表達(dá)的影響，將大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型組、針刺組，同樣在處死前注射BrdU，在7 d取材觀察大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體BrdU/Nestin陽性細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)在上述三個(gè)區(qū)域，針刺組的陽性細(xì)胞數(shù)與其他組相比均明顯升高，結(jié)果亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。刁利紅[25]等試圖通過針刺承漿、氣海、關(guān)元等任脈穴刺激腦缺血大鼠側(cè)腦室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)。發(fā)現(xiàn)針刺組新生NSC表達(dá)在7、14、28 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)與空白組和同時(shí)間點(diǎn)模型組相比顯著升高，說明針刺任脈對NSC表達(dá)亦有促進(jìn)作用。

3 討論

通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，針刺的確可以促進(jìn)腦卒中模型動(dòng)物腦組織內(nèi)NSC增殖，修復(fù)損傷神經(jīng)組織，繼而改善神經(jīng)功能缺損癥狀。目前對神經(jīng)再生技術(shù)的研究雖不斷取得突破，人們已能通過更多的方法使NSC擴(kuò)增，但這些方法在促進(jìn)NSC增殖的同時(shí)也會(huì)對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，如上述提到的排斥反應(yīng)、致畸作用，甚至是倫理問題等，使得該技術(shù)仍主要停留在實(shí)驗(yàn)室階段。針刺療法自古就是中醫(yī)治療腦病的主要方法，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展，人們也在不斷探討針刺對腦卒中起到治療作用的可能機(jī)制，針刺對干細(xì)胞影響的研究就是其中之一。如果說神經(jīng)再生技術(shù)為腦卒中的治療提供了新的思路，那么針刺療法則是將神經(jīng)再生技術(shù)引入到臨床治療腦卒中的一座橋梁。目前的實(shí)驗(yàn)多是在證明針刺對NSC能起到增殖作用，但對針刺如何能刺激NSC增殖的機(jī)制研究仍然不多，人們對其中的原因也眾說紛紜。有人認(rèn)為[26-28]，其可能的機(jī)制是針刺可以使腦血管擴(kuò)張，血流速度加快，從而使更多的氧進(jìn)入腦組織，為NSC的增殖提供好的內(nèi)環(huán)境；還有人認(rèn)為，由于NSC的增殖是靠多種調(diào)節(jié)因子和信號通路的參與共同實(shí)現(xiàn)的，所以針刺有可能是通過刺激某些調(diào)節(jié)因子或者刺激某些與神經(jīng)細(xì)胞增殖有關(guān)的通路來間接對NSC的增殖發(fā)揮作用?？傊嘘P(guān)針刺促進(jìn)NSC增殖的機(jī)制仍有待深入研究。

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[27] 楊春壯，馮克儉，劉星，等.電針對神經(jīng)干細(xì)胞海馬內(nèi)移植老年性癡呆大鼠行為學(xué)及海馬超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2012，40(4)：87-89.

[28] 王倩，范文濤，賀又舜.地黃飲子含藥血清對胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞遷移的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2015，43(1)：8-10.

Research Progress about the Effect on the Proliferation of Neural Stem Cellsafter Stroke by Acupuncture

ZHANG Beng1,2，SUN Xiao-wei2，ZOU Wei2*，SUN Meng-juan1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China；2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

The references in this article are derived from CNKI and Pubmed Databases by inputting the keywords such as stroke,neural stem cell and acupuncture.By summarizing the articles about the advances in the research of neural stem cell in recent years and the influence on the proliferation of neural stem cells of animals after stroke by acupuncture,we conclude that acupuncture can do promote the proliferation of neural stem cells and repair damaged neural tissues.However, the mechanism is still unclear.

Stroke;Neural stem cell;Acupuncture

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81273824)

張菶(1987-)，男，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士研究生在讀，主要研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療腦血管病臨床和機(jī)理研究。

鄒偉*(1965-)，男，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療腦血管病的臨床機(jī)理研究。

2016-06-21

R246

A

1002-2406(2016)06-0112-04

修回日期：2016-07-01