陳祥++魏臻武++任海龍等

摘要：以南苜蓿（Medicago polymorpha）為試驗材料，用CTAB法提取南苜?；蚪M，選擇已開發(fā)的蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）引物100對，分別在一年生苜蓿SSR-PCR反應(yīng)體系和苜蓿屬變種SSR-PCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，都得到了位點明顯、背景清晰的條帶。結(jié)果表明，南苜蓿均適合于現(xiàn)有的一年生苜蓿SSR-PCR反應(yīng)體系和苜蓿屬變種SSR-PCR反應(yīng)體系，建立了一套有效、成熟的應(yīng)用于南苜蓿SSR標(biāo)記的聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測的方法，該方法可以用于南苜蓿雜交F1代的鑒定以及后期資源的遺傳分析。

關(guān)鍵詞：南苜蓿；SSR標(biāo)記；PAGE

中圖分類號： S540.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0382-03

收稿日期：2014-11-10

基金項目：江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2012340）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃（編號：CXLX_1429）。

作者簡介：陳祥（1990—），男，江蘇揚州人，碩士研究生，研究方向為牧草種質(zhì)資源評價與遺傳育種。E-mail：yzdxchenxiang@163.com。

通信作者：魏臻武，博士，教授，主要從事牧草遺傳育種與種質(zhì)資源評價研究。E-mail：zhenwu_wei@hotmail.com。南苜蓿（Medicago polymorpha）屬于豆科苜蓿屬，是一年生或越年生苜蓿，別稱秧草、草頭、金花菜[1-2]、多形苜蓿[3]等。南苜蓿多產(chǎn)于長江中下游地區(qū)，如江蘇、浙江等地，在安徽、江西、云南等地也有分布。南苜蓿常作為田間綠肥，也可作蔬菜和牧草。目前，隨著秧草保健功能的不斷彰顯，多地已經(jīng)形成了以秧草為主的產(chǎn)業(yè)。南苜蓿實現(xiàn)了牧草功能的延伸，是長三角生態(tài)農(nóng)業(yè)新的增長點，成為我國南方草業(yè)發(fā)展的新亮點[4]。

簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR），是重復(fù)序列的重要組成部分。SSR是由1～6個核苷酸為重復(fù)單位序列組成的串聯(lián)重復(fù)序列。SSR以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，并均勻分布于整個基因組中。由于SSR分子標(biāo)記具有共顯性、涵蓋范圍廣、標(biāo)記數(shù)量豐富、所揭示的多態(tài)性高等優(yōu)點[5]，已經(jīng)在分子育種、指紋圖譜構(gòu)建、種子純度鑒定、基因定位等方面得到廣泛應(yīng)用[6-7]。同樣，對于遺傳背景缺乏、沒有測序信息的植物，SSR仍然具有極高的利用價值。

聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是一種以聚丙烯酰胺凝膠作為介質(zhì)的常用電泳技術(shù)。由于其檢測靈敏度和分辨率都比較高，是分子生物學(xué)和基因工程上不可缺少的試驗技術(shù)，特別適合SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測[8-9]。本研究在張麗芳等模式植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）SSR標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系[10]和Eujayl 等苜蓿屬變種PCR反應(yīng)體系[11]的基礎(chǔ)上，建立一種適用于南苜蓿SSR標(biāo)記的聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測的方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗所用的南苜蓿材料由揚州大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所野外搜集所得（表1），于2014年4月種植于揚州大學(xué)揚子津校區(qū)實驗地，在植株成型后取嫩葉研磨，提取的葉片DNA作為PCR反應(yīng)的模板。試驗所用的MgCl2、dNTP、Taq聚合酶試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2DNA提取

南苜蓿葉片基因組DNA提取采用魏臻武的CTAB法[12]。取10～15張葉片在液氮中迅速研磨成粉末，用于后續(xù)DNA的提取，提取的DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測質(zhì)量和濃度。樣品稀釋10倍放入4 ℃冰箱備用，原液放入-70 ℃冰箱長期保存。

1.3引物

引物來源于揚州大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所提供的100對蒺藜苜蓿SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物粉末用超純水稀釋，保證引物的濃度高于10 μmol/L。待完全溶解后在漩渦混合器中混勻，離心，放入-20 ℃冰箱中保存待用。

1.4PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序

SSR反應(yīng)體系[10]為10 μL（每孔添加量）。10 μL PCR體系含0.24 μL dNTP （10 μmol/L），3 μL Primer（10 μmol/uL），0.16 μL Taq polymerase（1 U），1.5 μL 10×buffer （1 μmol/L），3 μL DNA 模板（20～90 ng/μL），0.9 μL Mg2+（20 mmol/L），1.2 μL ddH2O。

一年生苜蓿PCR擴(kuò)增程序[13]：94 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性1 min，，55 ℃退火1.5 min （不同引物退火溫度不同），72 ℃延伸1min，共循環(huán)35次；最后72 ℃保溫8 min，4 ℃保存。

苜蓿屬變種PCR擴(kuò)增程序[11]：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s（不同引物退火溫度不同），72 ℃延伸90 s，共循環(huán)40次；最后72 ℃保溫10 min，4 ℃保存。

1.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入l L loading buffer （溴酚藍(lán)緩沖液），在8%非變性聚丙稀酰胺凝膠（PAGE）上，于100V電壓電泳0.5 h，200 V電壓電泳1 h，然后銀染檢測。

1.6圖片處理

電泳照片用Adobe Photoshop CS2 9.0進(jìn)行裁剪；引物信息采用Excel 2003整理。

2結(jié)果與分析

用100對蒺藜苜蓿SSR引物進(jìn)行親本母本溫嶺材料和父本楚雄材料及其雜交F1代多態(tài)性分析，篩選出8對多態(tài)性較好的作為南苜蓿特異性SSR引物，引物信息如表2所示。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，最后銀染上色，其結(jié)果見圖1、圖2。

試驗結(jié)果表明，蒺藜苜蓿SSR引物MtB152、MtB34、MtB147、MtB18、MtB21、MtB50、MtB16、MtB8在一年生苜蓿SSR-PCR反應(yīng)體系中和苜蓿屬變種SSR-PCR反應(yīng)體系中均能擴(kuò)增出條帶，但條帶質(zhì)量有差異。具體表現(xiàn)為一年生苜蓿SSR反應(yīng)體系擴(kuò)增出的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后得到的譜帶要比苜蓿屬變種的SSR反應(yīng)體系擴(kuò)增出的譜帶背景更加清晰，多態(tài)性位點更易于辨認(rèn)，但擴(kuò)增出的位點明顯少于苜蓿屬變種SSR的反應(yīng)體系。在2種反應(yīng)體系中，引物MtB18、MtB147、MtB50、MtB8擴(kuò)增出的條帶數(shù)明顯多于其他引物，多態(tài)性好于其他引物。

基于一年生苜蓿SSR反應(yīng)體系和苜蓿屬變種的SSR反應(yīng)體系，分別采用聚丙烯酰胺凝膠電泳后對南苜蓿進(jìn)行SSR標(biāo)記檢測，均能夠得到穩(wěn)定、易辨、背景清晰的譜帶，是一套快速有效的檢測方法。

3結(jié)論與討論

由于SSR的諸多優(yōu)點以及技術(shù)的日趨成熟，已經(jīng)成為一種比較理想的分子標(biāo)記技術(shù)，被廣泛運用到多個領(lǐng)域。在農(nóng)作物中，水稻（Oryza sativa）[14-15]、小麥（Triticum aestivum）[16-17]、玉米（Zea mays）[18]、大豆（Glycine max）[19]、大麥（Hordeum vulgare）[20]等都已進(jìn)行了SSR標(biāo)記的研究。

南苜蓿早期作為蔬菜和田間綠肥推廣[4]，在分子生物學(xué)研究方面，還沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報導(dǎo)，導(dǎo)致其遺傳背景缺乏，試驗工作無法借鑒，給遺傳育種工作帶來了困難。試驗證明，根據(jù)南苜蓿的分類學(xué)地位，將其作為一年生苜蓿屬植物的屬性來研究，能夠開展SSR分子標(biāo)記的研究。根據(jù)引物之間的通用性，已開發(fā)的蒺藜苜蓿SSR引物，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，在一年生苜蓿SSR-PCR反應(yīng)體系和苜蓿屬變種的SSR-PCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)之上，能夠擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性高的譜帶，可以用于南苜蓿試驗分析與交流。

要想獲得清晰可靠的條帶可以改變引物的退火溫度、Mg2+濃度以及反應(yīng)的循環(huán)數(shù)[21-22]?；谝荒晟俎SR反應(yīng)體系的譜帶要比苜蓿屬變種的SSR反應(yīng)體系的清晰，但是擴(kuò)增出的位點數(shù)要少于苜蓿屬變種的反應(yīng)體系，這可能與各自的反應(yīng)體系的退火溫度及循環(huán)次數(shù)有關(guān)，需要進(jìn)一步設(shè)計試驗來摸索證明，才能最終得到位點數(shù)多而且條帶清晰可靠的SSR-PCR反應(yīng)體系。

參考文獻(xiàn)：

[1]王 棟.牧草學(xué)各論[M]. 南京：畜牧獸醫(yī)圖書出版社，1956：170-171.

[2]陳默君，賈慎修. 中國飼用植物[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：579-580.

[3]南苜蓿[EB/OL]. [2014-10-02]. http：//www.eflora.cn/sp/Medicago%20polymorpha#map.

[4]曹德明，魏臻武，虞珍萍，等. 揚中金花菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展新模式——南方草業(yè)的新亮點[J]. 草原與草坪，2012（5）：79-82.

[5]徐興興，梁海永，甄志先，等. 蘋果SSR反應(yīng)體系的建立[J]. 果樹學(xué)報，2006，23（2）：161-164.

[6]Cook D R. Medicago truncatula—a model in the making！[J]. Current Opinion in Plant Biology，1999，2（4）：301-304.

[7]常金華，夏雪巖，張麗，等. 高粱抗蚜基因的遺傳分析和SSR標(biāo)記定位[J]. 草業(yè)學(xué)報，2006，15（2）：113-118.

[8]宋顯軍，張偉，曹萍，等. 大豆SSR標(biāo)記PAGE銀染方法的改進(jìn)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（16）：3922-3923.

[9]張芳，權(quán)軍利，單衛(wèi)星. 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測致病疫霉菌SSR標(biāo)記方法改良[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（27）：16606-16607.

[10]張麗芳，魏臻武，楊占花. 蒺藜苜蓿SSR反應(yīng)體系優(yōu)化及在一年生苜蓿種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用[J]. 草地學(xué)報，2007，15（5）：429-436.

[11]Eujayl I，Sledge M K，Wang L，et al. Medicago truncatula EST-SSRs reveal cross-species genetic markers for Medicago spp.[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，108（3）：414-422.

[12]魏臻武. 利用SSR、ISSR和RAPD技術(shù)構(gòu)建苜?；蚪MDNA指紋圖譜[J]. 草業(yè)學(xué)報，2004，13（3）：62-67.

[13]屠德鵬，魏臻武，武自念，等. 蒺藜苜蓿EST-SSRs分布特征及標(biāo)記的開發(fā)[J]. 草業(yè)科學(xué)，2011，28（5）：746-752.

[14]Wu K S，Tanksley S D. Abundance，polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice[J]. Molecular & General Genetics：MGG，1993，241（1/2）：225-235.

[15]Akagi H，Yokozeki Y，Inagaki A，et al. Microsatellite DNA markers for rice chromosomes[J]. Theoretical and Applied Genetics，1996，93（7）：1071-1077.

[16]Ma Z Q，Rder M，Sorrells M E. Frequencies and sequence characteristics of di-，tri-，and tetra-nucleotide microsatellites in wheat[J]. Genome，1996，39（1）：123-130.

[17]Plaschke J，Ganal M W，Rder M S. Detection of genetic diversity in closely related bread wheat using microsatellite markers[J]. Theoretical and Applied Genetics，1995，91（6/7）：1001-1007.

[18]Taramino G，Tingey S. Simple sequence repeats for germplasm analysis and mapping in maize[J]. Genome，1996，39（2）：277-287.

[19]Akkaya M S，Bhagwat A A，Cregan P B. Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean[J]. Genetics，1992，132（4）：1131-1139.

[20]Liu Z W，Biyashev R M，Maroof M A. Development of simple sequence repeat DNA markers and their integration into a barley linkage map[J]. Theoretical and Applied Genetics，1996，93（5/6）：869-876.

[21]Smulders M K. Use of short microsatellites from database sequence to gene rate polymorphisms among Lycopersicon esculentun cultivars and accessions of other Lyopersicon species[J]. Theoretical and Applied Genetics，1997，97：164-272.

[22]Rychlik W，Spencer W J，Rhoads R E. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro[J]. Nucleic Acids Research，1990，18（21）：6409-6412.王雪，羅照明，張紅城，等. 中國蜂膠膠源植物研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11：385-392.