謝宇奇　零學(xué)仕　周作樹等

摘要：以楓香樹葉為原料提取黑色素粗產(chǎn)品。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，以提取得率作為響應(yīng)值，對(duì)提取劑濃度、料液比、提取時(shí)間等3個(gè)主要影響因素進(jìn)行響應(yīng)面法分析，得到楓香樹葉黑色素提取的優(yōu)化工藝條件。結(jié)果表明，3個(gè)因素對(duì)楓葉黑色素提取得率影響由大到小依次為料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間，最優(yōu)提取工藝參數(shù)為乙醇濃度40%、料液比1 g ∶40 mL、最佳提取時(shí)間4 h，此條件下初步干燥的楓香樹葉黑色素粗產(chǎn)品的提取得率為41.47%。

關(guān)鍵詞：楓香樹葉；黑色素；優(yōu)化；提取工藝；工藝參數(shù)；響應(yīng)面分析法

中圖分類號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0348-04

收稿日期：2014-10-24

基金項(xiàng)目：廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：LX2014441）。

作者簡介：謝宇奇（1979—），男，壯族，廣西靖西人，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)及化學(xué)分析研究。E-mail：xiekey@sina.com。黑色素是廣泛存在于動(dòng)植物和微生物界的保護(hù)性色素[1-2]。天然黑色素具有抗病毒、抗輻射和提高免疫力等多種功效，能抑制艾滋病毒復(fù)制[3]、解蛇毒[4]，還能治療治療老年性癡呆癥、帕金森癥等與黑色素缺乏相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[5]。天然黑色素雖然存在較為廣泛，但是由于染色工序相對(duì)復(fù)雜，染色效果不穩(wěn)定、生產(chǎn)成本高等原因，違規(guī)添加人工合成色素，制造有毒“黑色”食品的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，存在致病安全隱患。從不同來源提取天然黑色素已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。人們已成功從黑米[6]、黑木耳[7]、花椒籽[8]等天然食品中提取出黑色素。楓香樹（Liquidambar formosana Hance）葉中含有豐富的花色苷類黑色素，具有有祛風(fēng)濕、行氣、解毒等功效[9]，常用于治療瘡癤腫痛及外傷出血等癥[10-11]，在藥用研究方面有重要開發(fā)價(jià)值[12-13]。我國壯族、黎族等少數(shù)民族利用楓香樹葉黑色素染制黑色糯米飯有著悠久的歷史，其安全性和藥用功效得到了長期檢驗(yàn)，是制取天然黑色素的理想原料。目前，楓香樹葉黑色素的提取工藝鮮見報(bào)道[14-16]。本試驗(yàn)以楓香樹葉為原料，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，從而為楓香樹葉黑色素的開發(fā)利用提供參考數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)材料和試劑楓香樹葉樣品：采集于廣西壯族自治區(qū)百色市右江區(qū)，洗凈后經(jīng)60 ℃干燥，粉碎備用；無水乙醇、石油醚、鹽酸、乙酸乙酯、丙酮等藥品均為國產(chǎn)AR級(jí)。

1.1.2儀器與設(shè)備UA-2700型分光光度計(jì)（日本島津公司）；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（河南鄭州市世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1楓香樹葉黑色素提取工藝流程提取工藝流程：新鮮葉片→洗凈后干燥→粉碎→稱質(zhì)量→浸漬提取→分離，收集濾液→以60 ℃烘干→黑色素粗產(chǎn)品。

黑色素提取得率計(jì)算：得率y=黑色素粗產(chǎn)品質(zhì)量/楓香樹葉粉末質(zhì)量×100%。

1.2.2提取劑的選擇準(zhǔn)確稱取相同質(zhì)量的楓香樹葉樣品5份，按1 g ∶30 mL的料液比分別加入蒸餾水、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、丙酮等提取劑，調(diào)節(jié)pH值<3.5，在相同水浴中浸漬提取1 h。以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心分離，準(zhǔn)確移取相同體積提取液，用相應(yīng)提取劑稀釋定容到相同容積容量瓶，并以相應(yīng)提取劑為參比，分別測210 nm處的吸光度。

1.2.3測定波長的選擇取楓香樹葉的乙醇提取液，稀釋到適合紫外-可見分光光度計(jì)工作的濃度后，在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，繪制吸光圖，從圖中選取最大吸收波長為本試驗(yàn)測定波長。

1.2.4提取溫度的選擇稱取5份1.00 g 楓香樹葉樣品置于100 mL錐形瓶中，按料液比為1 g ∶30 mL加入提取劑，調(diào)節(jié)pH<3.5，密封后分別在 40、50、60、70 ℃的水浴中恒溫浸提1 h。離心沉淀，取上層提取液，分別準(zhǔn)確移取25 μL上清液，并用相應(yīng)的提取劑定容至25.00 mL，以相應(yīng)的提取劑為參比，測210 nm波長的吸光度。

1.2.5楓香樹葉黑色素提取的單因素研究

1.2.5.1提取劑濃度的影響稱取5份楓香樹葉樣品1.00 g，置于100 mL錐形瓶中，分別按料液比1 g ∶30 mL加入20%、40%、50%、60%、80%的乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH值<35，密封后在60 ℃恒溫水浴中提取1 h。離心沉淀，分別移取25 μL上清液，并分別用相應(yīng)的提取劑定容至25.00 mL。以相應(yīng)的提取劑為參比，測210 nm波長處的吸光度。

1.2.5.2料液比的影響稱取5份楓香樹葉樣品1.00 g，置于100 mL錐形瓶中，分別按分別按料液比為 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g ∶mL）加入同濃度提取劑，調(diào)節(jié) pH值<3.5，密封后在60 ℃恒溫水浴中提取1 h。抽濾收集濾液，在恒溫干燥箱中用60 ℃烘至恒重，后計(jì)算成品得率。

1.2.5.3提取時(shí)間的影響稱取8份楓香樹葉樣品1.00 g，置于100 mL錐形瓶中，按1 g ∶30 mL的料液比加入提取劑，調(diào)節(jié)pH值<3.5，在 60 ℃的恒溫水浴中分別浸提 0.5、1、2、3、4、5、6、7 h。離心沉淀后，分別移取25 μL提取液，用相應(yīng)的提取劑定容至25.00 mL。以相應(yīng)的溶劑為參比，測210 nm波長處的吸光度。

1.2.6響應(yīng)面法優(yōu)化楓葉黑色素的提取工藝選取3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，因素水平編碼見表1。

2結(jié)果與分析

2.1楓香樹葉黑色素提取劑的選擇

各種提取劑的試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，由表2可知乙醇溶液的提取效率最高，本試驗(yàn)選取乙醇作為楓香樹葉黑色素的提取劑。

2.2楓香樹葉黑色素最大吸收波長的選擇

楓香樹葉黑色素的乙醇提取液在200～400 nm范圍內(nèi)的光吸收情況如圖1所示。

由圖1可知，在200～400 nm范圍內(nèi)，楓香樹葉黑色素乙醇提取液的吸光度先隨著波長增大而升高，在波長為210 nm左右時(shí)，其吸光度達(dá)到最大峰值，之后不斷下降，故本試驗(yàn)選取210 nm為楓香樹葉黑色素的測定波長。

2.3楓葉黑色素提取溫度的選擇

如表3所示，在40～70 ℃范圍內(nèi)，提取效率隨著溫度提高而上升。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著提取溫度增高，提取劑揮發(fā)損失也會(huì)增大，越接近乙醇沸點(diǎn)越明顯。綜合考慮提取效率和提取成本，本試驗(yàn)選擇60 ℃作為楓香樹葉黑色素的提取溫度。

2.4單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1乙醇濃度對(duì)楓香樹葉黑色素提取效率的影響由圖2可知，在20%～50%的乙醇濃度范圍內(nèi)，楓香樹葉黑色素的提取效率隨濃度提升，50%乙醇濃度時(shí)達(dá)到最大，之后再提高乙醇濃度，吸光度反而下降。因此選擇50%左右的乙醇作為提取劑是較為適宜的。

2.4.2料液比對(duì)楓葉黑色素提取工藝的影響料液比直接影響黑色素在固液兩相的濃度差。提高料液比，可以降低黑色素在溶劑中的濃度，進(jìn)而有利于楓香樹葉中尚未溶解的黑色素繼續(xù)向溶劑擴(kuò)散。但當(dāng)料液比大到一定程度，楓香樹葉中的黑色素基本溶出，再提高料液比，不僅不能提高提取得率，還會(huì)增加溶劑使用量，增加雜質(zhì)溶出的概率，并增加溶劑蒸發(fā)等后續(xù)工藝的難度，進(jìn)而提高提取工藝的成本。由圖3可知，當(dāng)料液比為1 g ∶30 mL～1 g ∶40 mL時(shí)，黑色素的得率處于較高水平，因此選擇料液比為1 g ∶30 mL～1 g ∶40 mL為宜。

2.4.3提取時(shí)間對(duì)楓葉黑色素提取工藝的影響由圖4可知，在0.5～4 h之間時(shí)，提取液的吸光度隨著提取時(shí)間的延長而增大，當(dāng)達(dá)4 h后，吸光度進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)，直到7 h后，才略有上升。綜合考慮提取工藝能耗等成本，本試驗(yàn)提取時(shí)間在4～6 h為宜。

2.5響應(yīng)面分析結(jié)果

2.5.1響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案對(duì)楓香樹葉黑色素的提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。以乙醇濃度x1、料液比x2、提取時(shí)間x3為自變量，以楓香樹葉黑色素粗產(chǎn)品提取得率y為響應(yīng)值。Box-Behnken分析方案及試驗(yàn)結(jié)果見表3。

2.5.2回歸方程和方差分析用Design-Expert 8.0.5b軟件程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出楓葉黑色素提取得率

由表4可分析出，用以上回歸方程描述楓香樹葉黑色素提取工藝中各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著，相關(guān)系數(shù)R2為98.32，模型的顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05，此Quadratic回歸方差模型為高度顯著。

由表4的分析可知，楓葉黑色素提取工藝中各個(gè)因素影響得率從大到小的順序依次為料液比（x2）、乙醇濃度（x1）和提取時(shí)間（x3），其中料液比對(duì)楓葉黑色素提取得率的影響最為顯著。

2.5.3響應(yīng)面圖分析由圖5、圖6、圖7可知，楓香樹葉黑色素的提取工藝中，料液比（x2）的影響最為顯著，提取時(shí)間（x3）和提取劑乙醇濃度（x1）次之。

利用Design-Expert 8.0.5b軟件程序?qū)魅~黑色素的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，可得最佳方案為乙醇濃度（x1）40%、料液比（x2）為1 g ∶40 mL、提取時(shí)間（x3）4 h。在此提取工藝條件下，初步干燥的楓葉黑色素粗產(chǎn)品的提取得率預(yù)測值為41.73%。

2.5.4模型的驗(yàn)證性試驗(yàn)固定乙醇濃度為40%、料液比為1 g ∶40 mL、提取時(shí)間4 h，平行提取3次，得到未除雜、60 ℃烘干后的楓香樹葉黑色素粗產(chǎn)品，平均提取率為41.47%。試驗(yàn)值與模型理論預(yù)測值基本一致，說明優(yōu)化方案是可行的。

3結(jié)論

經(jīng)響應(yīng)面法分析，影響楓香樹葉黑色素粗產(chǎn)品提取率的主要因素的影響大小依次為料液比，乙醇濃度，提取時(shí)間。楓香樹葉最優(yōu)提取工藝參數(shù)為乙醇濃度為40%，料液比1 g ∶40 mL、最佳提取時(shí)間4 h。黑色素粗產(chǎn)品經(jīng)60 ℃烘干后的實(shí)際提取得率為41.47%，形態(tài)為黑色塊狀固體。本研究為楓香樹葉黑色素的綜合開發(fā)應(yīng)用提供了參考。

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