朱淑云　段笑園　徐琴等

摘要：研究了不同酶解程度對水飛薊蛋白理化特性（包括氨基酸組成、相對分子質量、溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性）的影響。結果表明：水飛薊蛋白進行不同酶解處理后，氨基酸組成發(fā)生了變化，一些抗氧化氨基酸的含量提高，相對分子質量變小，酶解物的溶解性提高，持油性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中水解度5%的持油性最好，酶解物的乳化性和乳化穩(wěn)定性都較酶解前有所提高。本研究結果為水飛薊蛋白的改性提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

關鍵詞：水飛薊蛋白；酶解程度；理化特性；氨基酸組成

中圖分類號： TS201文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0346-02

收稿日期：2014-12-11

基金項目：江蘇省鎮(zhèn)江市農業(yè)科技支撐項目（編號：NY2012031）；江蘇大學大學生科研立項資助項目（編號：13A109）；江蘇大學大學生實踐創(chuàng)新訓練項目（編號：201410299169W）。

作者簡介：朱淑云（1975—），女，山東青島人， 博士，副教授，主要從事食品生物技術研究工作。E-mail：shyzhu@eyou.com。水飛薊是一種傳統(tǒng)的藥用植物，其藥用成分水飛薊素主要存在于水飛薊籽殼中，其籽仁中主要含有蛋白質、油脂和淀粉等物質[1]。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊籽仁脫脂粉中蛋白質含量高達47.23%，水飛薊蛋白以清蛋白為主，其氨基酸種類齊全，是一種優(yōu)質的植物蛋白[2-3] 。然而目前國內外學者對水飛薊的研究主要集中在對水飛薊素的開發(fā)利用上，對水飛薊蛋白的研究較少[4-6]。若對水飛薊蛋白進行深入開發(fā)研究，必將顯著提高水飛薊加工的附加值。蛋白質可通過物理、化學和蛋白酶法對其進行改性。利用蛋白酶限制性的水解蛋白來提高蛋白質的功能特性，具有作用條件溫和，不破壞氨基酸結構，產生有害物質的可能性小，安全性高等優(yōu)點，而且通過酶解產生的小分子物質更易被人體消化吸收，因此利用酶法對蛋白質進行改性已經成為當今最重要的蛋白質改性技術。目前國內研究蛋白酶解改性主要集中在蛋白酶的選擇與酶解工藝的優(yōu)化，有少數(shù)研究是針對酶解程度對產物理化特性的影響[7-9]，但是酶解程度對水飛薊蛋白理化特性的影響尚未見研究報道。因此，本研究擬通過中性蛋白酶酶解水飛薊蛋白，考察不同酶解程度下水飛薊蛋白的氨基酸組成及理化性質的變化，以期為水飛薊蛋白的改性以及水飛薊活性肽的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1材料和試劑

水飛薊蛋白：自制；中性蛋白酶：無錫杰能科酶制劑公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

ALPHAI-4/2-4 型冷凍干燥機：德國CHRIST公司；Agilent 1100液相色譜：美國安捷倫公司；WFJ7200 可見光分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1水飛薊蛋白的限制性酶解方法將水飛薊蛋白配制成一定濃度的溶液，調節(jié)pH值和溫度，加入適量的中性蛋白酶進行酶解。反應過程中不斷加入0.5 mol/L NaOH溶液保持反應體系的pH值恒定。當達到預期水解度時，將反應液置于90 ℃保溫滅酶，4 000 r/min離心20 min，上清液經濃縮后冷凍干燥即得蛋白酶解物。

1.3.2水飛薊蛋白水解度的測定采用pH-stat法測水解度（DH）[10]。

1.3.3氨基酸組成的測定采用酸水解法。

1.3.4分子質量分布的測定采用高效液相色譜法。

1.3.5溶解性的測定采用考馬斯亮藍比色法。準確稱取0.20 g樣品溶于20 mL蒸餾水中，分別調節(jié)pH值至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室溫攪拌30 min，然后4 000 r/min離心20 min，取1.0 mL上清液測定蛋白質含量。溶解度以上清液中蛋白質含量占體系中蛋白總量的百分比表示。

1.3.6持油性和乳化性的測定按參考文獻[11]的方法進行。

2結果與分析

2.1酶解程度對水飛薊蛋白氨基酸組成的影響

由表1可知，不同酶解程度的水飛薊蛋白酶解物都富含谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和絲氨酸等氨基酸，隨著酶解程度的提高，各氨基酸的含量都有所變化，其中一些抗氧化氨基酸（組氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸）的含量都較酶解前有所提高，其中甲硫氨酸的含量增加最顯著，它們應該是酶解物具有抗氧化活性的重要物質基礎，在一定程度上影響著不同酶解程度的酶解產物的抗氧化活性。

2.2酶解程度對水飛薊蛋白相對分子質量的影響

由表2可知，隨著酶解程度的增大，相對分子質量大于1 000 u的肽段的含量逐漸減少，小于1 000 u的肽段含量則逐漸增加。在180～1 000 u范圍的組分含量由DH5%時的47.13%提高到了DH15%時的57.02%。大量研究證明：抗氧化肽多是分子質量<1 000 u的寡肽[12]，因此，通過比較不同酶解度酶解產物的相對分子質量分布，有助于解釋其所具有的抗氧化活性的差異。

2.3酶解程度對水飛薊蛋白溶解性的影響

水飛薊蛋白及其水解物的溶解度見圖1。從圖1可見，水飛薊蛋白具有典型的溶解度曲線，其在pH值5左右具有最低的溶解度。水解物呈現(xiàn)出與蛋白完全不一樣的溶解度曲線，3種水解物在pH值5左右的低溶解性區(qū)域已消失，在所有測定的pH值范圍內，水解物都具有較高的溶解性，不同水解度的水解物之間的溶解性也呈現(xiàn)出一定差異，隨著水解度增大，各個pH值下的溶解性略有增高。

2.4酶解程度對水飛薊蛋白持油性的影響

由圖2可知，隨著水解度的增大，酶解物的持油性逐漸降低。其中DH5%的水解物的持油性最好，比水飛薊蛋白的持油性提高了33%左右，這可能是由于低度水解時，蛋白分子結構改變，分子中疏水基團暴露，使水解物的吸油性顯著提高。但隨著水解度的增大，多肽鏈被降解成更短的肽段，電荷的數(shù)量增加，極性增強，親水基團增加，不利于形成蛋白質凝膠網(wǎng)絡結構，導致吸油性降低[10]。

2.5酶解程度對水飛薊蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的的影響

由圖3可知，在有限水解范圍內，中性蛋白酶水解產物比水飛薊蛋白具有更好的乳化性，由于水解使蛋白質分子變小，構象發(fā)生了改變，一些包埋于蛋白質內部的疏水性殘基暴露出來，利于其向水油界面擴散降低界面張力，同時水解后的肽分子更易定位于水油界面，所以酶解物的乳化活性較蛋白有一定的提高。由圖4可知，水解物的乳化穩(wěn)定性都高于水飛薊蛋白，但隨著水解度的增大酶解物的乳化穩(wěn)定性逐漸降低，其中DH5%的水解物的乳化穩(wěn)定性最高。可能是由于水解度的進一步提高，使更多極性基團暴露，包裹在油滴表面的肽段越來越小，使油滴表面的保護層越來越薄，最終導致了乳化穩(wěn)定性的降低。

3結論

本研究比較了水解程度對水飛薊蛋白氨基酸組成和理化性質的影響。研究發(fā)現(xiàn)水飛薊蛋白經水解以后，各種氨基酸的含量都有所變化，特別是一些抗氧化氨基酸的含量都較酶解前有所提高；水解使水飛薊蛋白的相對分子質量發(fā)生了變化，隨著水解度的提高，相對分子質量較小的肽段逐漸增加；水解產物的溶解性顯著提高；水解產物的乳化性和乳化穩(wěn)定性都較水飛薊蛋白有所提高，深度水解后的乳化穩(wěn)定性有所下降。

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