云巾宴　任春宇　車達(dá)等

摘要：為檢測(cè)牛、羊等反芻動(dòng)物的氣腫疽梭菌，篩選出更為特異、敏感的PCR檢測(cè)方法，分別以fliA（C）、nanA、cctA為靶基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，并對(duì)其敏感性、特異性等方面進(jìn)行比較。結(jié)果表明，以cctA為靶基因的PCR檢測(cè)方法敏感性最高，最小檢測(cè)DNA量為12.30×10-5 pg/μL；以fliA（C）、nanA為靶基因的PCR檢測(cè)方法敏感性較低，最小檢測(cè)DNA量為0.123 ng/μL；3種靶基因引物菌未擴(kuò)增出D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌、巴氏桿菌等基因片段，具有較好的特異性。本試驗(yàn)為氣腫疽的快速診斷提供了更為敏感、特異的檢測(cè)技術(shù)。

關(guān)鍵詞：氣腫疽梭菌；fliA（C）基因；nanA基因；cctA基因；PCR方法

中圖分類號(hào)： S855.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0278-02

收稿日期：2014-11-27

基金項(xiàng)目：吉林省教育科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目[編號(hào)：吉教科合字（2014）第6號(hào)]。

作者簡(jiǎn)介：云巾宴（1990—），女，吉林長(zhǎng)春人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)研究。E-mail：yunjinyan@hotmail.com。

通信作者：金鑫，博士，教授，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)研究。E-mail：jinxin@ybu.edu.cn。氣腫疽別稱黑腿病，是由氣腫疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的牛、羊等反芻動(dòng)物的急性、熱性、敗血性傳染病[1]。動(dòng)物感染氣腫疽梭菌的典型癥狀為觸診肌肉部位有捻發(fā)音，穿刺或切開腫脹處如同天然孔，流出泡沫樣的暗紅色血液[2-3]。氣腫疽呈散發(fā)性流行或地方性流行，一年四季均可發(fā)病，尤以炎熱干旱的夏季容易發(fā)生，冬季則較少見。氣腫疽梭菌的芽孢具有很強(qiáng)的存活力，可在土壤中存活5年之久，在腐敗的尸體中也可存活3個(gè)月，因此難以從根本上預(yù)防并控制本病的發(fā)生和流行，使畜牧業(yè)蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank上已公布的氣腫疽梭菌fliA（C）基因序列（AB058931）、nanA基因序列（FM213082）、cctA基因序列（JQ692583）設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，并從特異性、敏感性方面對(duì)建立的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較分析，以期為氣腫疽的快速診斷篩選出更簡(jiǎn)便、快捷、高效的檢測(cè)技術(shù)。1材料與方法

1.1模板與試劑

以氣腫疽梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C54-1全基因組DNA為模板。 r Taq DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；NI-DL 3 000 DNA Marker購(gòu)自Newbio Industry公司；D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌、巴氏桿菌均由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上已公布的氣腫疽梭菌fliA（C）基因序列（AB058931）、nanA基因序列（FM213082）、cctA基因序列（JQ692583），采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物（表1），由北京新產(chǎn)業(yè)公司合成。

1.3DNA模板的制備及濃度測(cè)定

采用酚-三氯甲烷抽提法提取氣腫疽梭菌菌體核酸DNA，并用紫外分光光度儀測(cè)定其濃度。

1.4PCR反應(yīng)

以氣腫疽梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C54-1全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：10×buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、DNA模板2 μL、上下游引物各1 μL（10 pmol/L）、r Taq 0.25 μL，用水補(bǔ)齊至25 μL。以fliA（C）、nanA、cctA為靶基因，優(yōu)化后的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5.0 ℃預(yù)變性5 min；95.0 ℃變性45 s，43.4 ℃退火 45 s，72.0 ℃延伸 45 s，35個(gè)循環(huán)；72.0 ℃延伸10 min，4.0 ℃反應(yīng)結(jié)束。95.0 ℃預(yù)變性5 min；95.0 ℃變性45 s，42.5 ℃退火 45 s，720 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72.0 ℃延伸10 min，4.0 ℃ 反應(yīng)結(jié)束。95.0 ℃預(yù)變性5 min；95.0 ℃變性45 s，488 ℃退火 45 s，72.0 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72.0 ℃延伸 10 min，4.0 ℃ 反應(yīng)結(jié)束。采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.5特異性試驗(yàn)

以D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌、巴氏桿菌的基因組DNA為模板，以滅菌去離子水為陰性對(duì)照，分別用3對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以判斷其特異性。

1.6敏感性試驗(yàn)

提取氣腫疽梭菌菌體DNA并測(cè)其D260 nm值，將DNA模板按1 ∶10比例連續(xù)稀釋后，分別用3對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，以確定PCR方法的敏感性。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA的濃度

提取氣腫疽梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C54-1菌體DNA后，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其D260 nm值，計(jì)算得到DNA濃度為12.3 ng/μL。

2.2特異性試驗(yàn)結(jié)果

分別以氣腫疽梭菌、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌、巴氏桿菌的基因組DNA為模板，以滅菌去離子水為陰性對(duì)照，按照“1.4”節(jié)的擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件，采用3對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果（圖1）顯示，氣腫疽梭菌擴(kuò)增出了特異性目的條帶，而其他均未出現(xiàn)目的條帶，表明3種靶基因的PCR檢測(cè)方法均具有較好的特異性。

2.3敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將氣腫疽梭菌菌體DNA標(biāo)準(zhǔn)品按1 ∶10比例稀釋后，采用上述PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果（圖2）顯示，3種靶基因的PCR檢測(cè)方法中，以cctA為靶基因的PCR方法敏感性最高，最小檢測(cè)DNA量為 12.30 fg/μL；以fli（A）、nanA為靶基因的PCR方法敏感性較低，最小檢測(cè)DNA量同為123.0 pg/μL。

3結(jié)論與討論

目前，診斷牛、羊等反芻動(dòng)物的氣腫疽病主要采用間接ELISA、普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、套式PCR、二重PCR、多重實(shí)時(shí)定量PCR等分子生物學(xué)診斷方法[6-11]。PCR檢測(cè)方法因其特異性強(qiáng)、靈敏度高而被廣泛采用，但由于不同基因的開放閱讀框穩(wěn)定性不同，其特異性、敏感性受到不同程度的影響；因此，有必要篩選出特異性好、敏感度高的氣腫疽病PCR診斷方法。

近年來(lái)，Moussa報(bào)道的氣腫疽梭菌鞭毛蛋白不僅是一種重要的保護(hù)性抗原，也是引起生物體感染和發(fā)病的重要毒力因子[12]。唾液酸酶別稱神經(jīng)氨酸酶、NanA，分子質(zhì)量為81 ku，編碼722個(gè)氨基酸，是由2個(gè)分子質(zhì)量為72 ku的多肽所組成的150 ku的二聚體。該酶可作為反芻動(dòng)物抵抗病原體入侵、防治黑腿病感染的優(yōu)秀候選基因[13]。氣腫疽梭菌細(xì)胞毒素A（CctA）是Frey等通過(guò)全基因序列分析得出的一種新型蛋白質(zhì)毒素，該毒素是細(xì)菌毒素的殺白細(xì)胞素總科、β-微孔形成毒素家族中的一種。細(xì)胞毒素A是氣腫疽梭菌的主要細(xì)胞毒素和溶血素，也是黑腿病疫苗研究中極具價(jià)值的候選基因[14]。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank上已公布的氣腫疽梭菌fliA（C）基因序列（AB058931）、nanA基因序列（FM213082）、cctA基因序列（JQ692583）設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，并從特異性、敏感性方面對(duì)建立的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，3對(duì)引物均具有較強(qiáng)的特異性，而以cctA為靶基因設(shè)計(jì)的引物最為敏感，其最小檢測(cè)DNA量為1.230×10-5 pg/μL。本試驗(yàn)通過(guò)比較不同靶基因PCR檢測(cè)方法，篩選出以cctA為靶基因引物的PCR方法，為氣腫疽病臨床診斷提供了可靠技術(shù)手段。

參考文獻(xiàn)：

[1]王正興. 山區(qū)牛氣腫疽診斷與防制[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，2011（2）：107.

[2]陸安法，徐官紅，簡(jiǎn)廷安，等. 牛氣腫疽的防制[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2003，24（6）：131-131.

[3]姜丹丹. 氣腫疽梭菌單克隆抗體的制備及膠體金診斷試紙條的研制[D].延吉：延邊大學(xué)，2013：1-45.

[4]白實(shí)，郭宇鵬，李艷華，等. 敦化地區(qū)黃牛氣腫疽的防治與診斷[J]. 吉林畜牧獸醫(yī)，2007，28（6）：38-39.

[5]Groseth P K，Ersdal C，Bjelland A M，et al. Large outbreak of blackleg in housed cattle[J]. The Veterinary Record，2011，169（13）：339.

[6]車達(dá)，金鑫，陳瑩瑩，等. 延邊黃牛氣腫疽間接ELISA診斷方法的建立[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（2）：1042-1044.

[7]Uzal F A，Hugenholtz P，Blackall L L，et al. PCR detection of Clostridium chauvoei in pure cultures and in formalin-fixed，paraffin-embedded tissues[J]. Veterinary Microbiology，2003，91（2/3）：239-248.

[8]Halm A，Wagner M，Kfer J，et al. Novel real-time PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum in clostridial myonecrosis[J]. Journal of Clinical Microbiology，2010，48（4）：1093-1098.

[9]姜丹丹，金鑫，陳瑩，等. 氣腫疽梭菌套式PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2010，40（11）：1171-1174.

[10]彭小兵，李旭妮，王楠，等. 二重PCR方法鑒別氣腫疽梭菌和腐敗梭菌[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2011，45（3）：20-22.

[11]Lange M，Neinrich H，Seyboldt C. Development and validation of a multiplex real-time PCR for detection of Clostridium[J]. Molecular and Cellular Probes，2010，24（4）：204-210.

[12]Kojima A，Uchida I，Sekizaki T，et al. Cloning and expression of a gene encoding the flagellin of Clostridium chauvoei[J]. Veterinary Microbiology，2000，76（4）：359-372.

[13]Vimr E R，Kalivoda K A，Deszo E L，et al. Diversity of microbial sialic acid metabolism[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2004，68（1）：132-153.

[14]Frey J，Johansson A，Bürki S，et al. Cytotoxin CctA，a major virulence factor of Clostridium chauvoei conferring protective immunity against myonecrosis[J]. Vaccine，2012，30（37）：5500-5505.陳圓，張龍，王瑩，等. 金雀異黃素殼聚糖納米粒子體外釋放動(dòng)力學(xué)研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11

：280-282.