劉悅　金中時(shí)　王鳳良等

摘要：黃萎病是棉花生產(chǎn)中最具毀滅性病害之一，種植抗病品種是控制黃萎病害最為有效途徑之一。本試驗(yàn)通過(guò)花粉管通道法將hpa1Xoo基因?qū)腙懙孛奁废?54，經(jīng)多代選育獲得了可穩(wěn)定遺傳表達(dá)hpa1Xoo基因且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的2個(gè)棉花材料854-3、854-5，具有出苗快、長(zhǎng)勢(shì)較好、整齊度高、植株中等、株型松、莖稈毛少光滑、葉片大、葉色深綠、葉功能較好、結(jié)鈴性較強(qiáng)、鈴形較大、吐絮暢等特點(diǎn)。2013—2014年854-3、854-5株高98.0～114.0 cm，單株果枝15.60～18.10個(gè)，單株結(jié)鈴26.90～48.45個(gè)，鈴質(zhì)量5.26～5.92 g，衣分39.54%～45.10%，籽棉產(chǎn)量3 186.45～5 023.65 kg/hm2，皮棉產(chǎn)量1 437.5～1 998.45 kg/hm2。854-3、854-5黃萎病指數(shù)分別為4.23、2.80，均為高抗水平。854-3、854-5纖維上半部平均長(zhǎng)度分別為28.78、28.83 mm，斷裂比強(qiáng)度分別為27.9、28.4 cN/tex，馬克隆值分別為5.67、5.83，伸長(zhǎng)率分別為6.3%、6.2%。854-3、854-5纖維外觀色澤潔白，手感有彈性，內(nèi)在品質(zhì)優(yōu)良，可為棉花抗病品種選育提供種質(zhì)或材料。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因棉花；hpa1Xoo基因；抗黃萎??；農(nóng)藝性狀

中圖分類號(hào)： S435.621文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0170-05

收稿日期：2015-02-06

基金項(xiàng)目：教育部博士點(diǎn)基金（編號(hào)：20104601110004、20124601110004）；國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31160359、31360029）；國(guó)家科技部項(xiàng)目（編號(hào)：2004BA901A36）。

作者簡(jiǎn)介：劉悅（1990），女，黑龍江人，碩士研究生，從事植物病理學(xué)研究。E-mail：heizi2327@126.com。

通信作者：繆衛(wèi)國(guó)，博士，教授，從事分子植物病理學(xué)研究。E-mail：weiguomiao1105@126.com。在世界范圍內(nèi)棉花是非常重要的纖維作物，也是食用油料來(lái)源之一。是僅次于糧食的第二大農(nóng)作物[1]。黃萎病是棉花成株期危害最大的病害之一。棉花黃萎病的病原菌為大麗輪枝菌（Verticillium dahlia Klebahn），對(duì)棉花質(zhì)量、皮棉產(chǎn)量、纖維品質(zhì)影響非常嚴(yán)重[2-3]。1993年，棉花黃萎病在我國(guó)大暴發(fā)，發(fā)病面積達(dá)266.67萬(wàn) hm2，損失皮棉約1億 kg，2002—2003年黃萎病再度暴發(fā)，棉花黃萎病已成為棉花減產(chǎn)的主要原因之一[4-5]。選育高產(chǎn)抗病品種對(duì)有效控制該類病害尤為重要。多年來(lái)，我國(guó)對(duì)篩選與培育新品種的方法不斷更替革新，由開(kāi)始常規(guī)棉育種至現(xiàn)在利用轉(zhuǎn)基因、分子標(biāo)記與生化輔助育種等技術(shù)，定向、高效培育出高產(chǎn)、抗病蟲、優(yōu)質(zhì)的復(fù)合抗性品種[6]。如轉(zhuǎn)基因Bt抗蟲棉，不僅在抗棉鈴蟲方面有顯著成效，還能夠增強(qiáng)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)害蟲自然控制的能力，世界范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了大范圍的推廣種植[7-8]。但至今對(duì)于抗病轉(zhuǎn)基因棉的研究成效甚微，未見(jiàn)抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花大面積種植的報(bào)道，生產(chǎn)上大面積種植的棉花品種對(duì)棉花黃萎病的抗性仍處于抗病或耐病水平，缺乏高抗黃萎病棉花品種的報(bào)道。

Wei等首次從梨火疫病菌（Erwinia amylovora）中分離和鑒定了一種能夠激發(fā)非寄主植物發(fā)生過(guò)敏性反應(yīng)（hypersensitive resistence，HR）的蛋白激發(fā)子，命名為harpinEa[9]。目前，人們已經(jīng)在Erwinia、Psedomonas、Xanthomonas等屬的多種植物病原細(xì)菌中克隆到編碼harpin蛋白的hrp（hypersensitive response and pathogenicity，hrp）基因[10-17]。人們已經(jīng)將編碼harpin蛋白的基因成功轉(zhuǎn)入到煙草、馬鈴薯、蘋果、梨、甜菜、小麥、棉花[18-26]及水稻[15，17，27-29]等植物中，獲得的轉(zhuǎn)基因植物都對(duì)其主要病原菌產(chǎn)生了較好的復(fù)合抗性。

hpa1Xoo是來(lái)自水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）編碼harpinXoo蛋白的hrp基因[17]，筆者項(xiàng)目組用含農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)域的重組質(zhì)粒，通過(guò)花粉管通道法將hpa1Xoo基因?qū)攵鄠€(gè)陸地棉，結(jié)合常規(guī)育種獲得具有多種有益表型如抗棉花黃萎病、枯萎病、棉鈴蟲等的后代株系[30]。在此基礎(chǔ)上，2008—2014年項(xiàng)目組選用抗病較差但農(nóng)藝性狀較好的陸地棉材料854，將hpa1Xoo基因?qū)?54，通過(guò)系統(tǒng)選育獲得了穩(wěn)定表達(dá)的后代株系854-3、854-5，在2013—2014年對(duì)854-3、854-5的黃萎病抗性、農(nóng)藝性狀等方面與泗棉3號(hào)、中植棉2號(hào)進(jìn)行了比較，以期為棉花抗病品種選育及病害有效防控提供優(yōu)良種質(zhì)。

1材料與方法

1.1材料

陸地棉材料854-3、854-5是以854（江蘇科騰種業(yè)有限公司提供）為轉(zhuǎn)化受體的轉(zhuǎn)hpa1Xoo基因棉花的遺傳穩(wěn)定后代株系，抗性標(biāo)記基因?yàn)閚ptⅡ[28]。對(duì)照為中植棉2號(hào)（抗?。?、泗棉3號(hào)（感?。?。

1.2試劑

卡那霉素（5 000 mg/L）、膠回收試劑盒、DNA試劑盒與RNA試劑盒均購(gòu)自BIOMIGA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TianGen公司；GoldView DNA染料購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；引物由華大基因引物合成。DNA測(cè)序由華大基因完成。

1.3方法

1.3.1卡那霉素抗性篩選參照繆衛(wèi)國(guó)的方法[31]，當(dāng)棉苗長(zhǎng)出2～3張真葉時(shí)，用5 000 mg/L濃度的卡那霉素對(duì)葉片均勻涂抹，無(wú)黃色斑痕的為卡那霉素抗性植株，以此作為陽(yáng)性植株進(jìn)行下一步分子篩選。

1.3.2轉(zhuǎn)基因棉抗病性考察試驗(yàn)選擇在江蘇大豐大中鎮(zhèn)紅花村發(fā)病均勻的棉花黃萎病重病田進(jìn)行，田間管理同大田常規(guī)方法。病情考察分2個(gè)時(shí)期進(jìn)行，黃萎病第1發(fā)病峰在棉花蕾花期（7月中下旬），黃萎病第2發(fā)病峰在棉花鈴期（9月下旬），調(diào)查發(fā)病率，計(jì)算病情指數(shù)，參照顧本康等的方法[32]劃分抗病等級(jí)。

1.3.3農(nóng)藝性狀調(diào)查棉花采用育苗移栽的方式種植，4月中旬播種，5月中旬移栽。試驗(yàn)田采用隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次，小區(qū)長(zhǎng)8 m、寬4 m，行距1 m，株距30 cm，每個(gè)區(qū)組設(shè)1個(gè)感病對(duì)照（泗棉3號(hào)）、1個(gè)抗病對(duì)照（中植棉2號(hào)）。調(diào)查項(xiàng)目包括吐絮期株高、單株果枝數(shù)、單株鈴數(shù)和吐絮個(gè)數(shù)，并考察皮棉、籽棉產(chǎn)量、單鈴質(zhì)量、衣分等指標(biāo)。采集植株中部鈴50個(gè)，稱量其纖維20～30 g送檢（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所農(nóng)業(yè)部棉花纖維檢測(cè)中心檢測(cè)）。

1.3.4統(tǒng)計(jì)分析參照顧本康等的抗病性鑒定方法[32]，抗病性指標(biāo)計(jì)算公式如下：

發(fā)病率=（∑病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%；

病情指數(shù)=[∑（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)病級(jí)）/（調(diào)查總株數(shù)×4）]×100%；

相對(duì)抗性指數(shù)（IR）=校正系數(shù)K×鑒定材料病指；

校正系數(shù)K=50/本次鑒定感病對(duì)照病指（50為感病對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)病指）。

比較854-3、854-5這2個(gè)株系（材料）與對(duì)照品種在2013—2014年的抗病性與農(nóng)藝性狀，對(duì)均值進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)，依據(jù)測(cè)驗(yàn)值的顯著水平確定供試材料的品質(zhì)優(yōu)劣。

1.3.5PCR與RT-PCR檢測(cè)采用DNA提取試劑盒（E.Z.N.A. HP Plant DNA Kit）提取棉花4～5張真葉期時(shí)的葉片總DNA，參照繆衛(wèi)國(guó)等方法[31]，用引物hpa1Xoo（Forward：5′-TTCGGATCCATGAACTCTTTGAACACACAATT-3′；Reverse：5′-GGTGAGCTCTTACTGCATCGATGCGCT-3′） PCR擴(kuò)增目的基因hpa1Xoo全長(zhǎng)。其程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min，然后95 ℃變性45 s，56 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，此循環(huán)進(jìn)行35次；最后72 ℃延伸10 min。

利用RNA提取試劑盒（E.Z.N.A. Plant RNA Kit RNA）提取花鈴期棉葉的RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Quant Reverse Transcriptase）進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。使用hpa1Xoo引物（同上），以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行PCR，程序同上。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因棉花的黃萎病抗性

2008年，我們采用花粉管通道法結(jié)合農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將來(lái)自水稻白葉枯病菌編碼harpin蛋白的hpa1Xoo基因?qū)胧荏w陸地棉材料854[30]，通過(guò)卡那抗性和抗病性田間篩選，結(jié)合分子驗(yàn)證，經(jīng)單株選育，獲得了854-3、854-5，2個(gè)農(nóng)藝表型穩(wěn)定的材料。2013—2014年，繼續(xù)觀察854-3、854-5農(nóng)藝性狀和對(duì)黃萎病的抗病性。結(jié)果表明，在江蘇大豐大中鎮(zhèn)紅花村棉花黃萎病重病田，抗病對(duì)照中植棉2號(hào)相對(duì)病情指數(shù)為12.41～16.68，平均為14.54，感病對(duì)照泗棉3號(hào)病情指數(shù)為42.76～50.00，平均為46.38，每年3個(gè)區(qū)組的感病對(duì)照泗棉3號(hào)黃萎病病情指數(shù)均在50左右，重復(fù)間、年度間差異不顯著，表明供試黃萎病病田發(fā)病均勻，適宜做病圃開(kāi)展棉花品種（材料）抗病性鑒定（表1）。854-3、854-5在2013—2014年平均病情指數(shù)分別為4.23、2.80，最高為6.01，最低為2.02，分別較抗病對(duì)照中植棉2號(hào)相對(duì)病情指數(shù)低70.9%、80.7%，較感病對(duì)照泗棉3號(hào)相對(duì)病情指數(shù)低 90.9%、94.0%，參照棉花品種抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)[32]，二者均屬于高抗。

2.2轉(zhuǎn)基因棉花的主要農(nóng)藝性狀及經(jīng)濟(jì)性狀

2.3轉(zhuǎn)基因棉花纖維品質(zhì)性狀

2014年，對(duì)854-3、854-5纖維樣品進(jìn)行品質(zhì)檢測(cè)，纖維品質(zhì)性狀良好，纖維長(zhǎng)度分別為28.78、28.83 mm，比強(qiáng)度分別為27.9、28.4 cN/tex，馬克隆值分別為5.67、5.83，伸長(zhǎng)率分別為6.3%、6.2%，整齊度分別為85.4%、84.7%（表3）。

2.4PCR、RT-PCR、PCR-Southern blot檢測(cè)結(jié)果

從整齊排列生長(zhǎng)一致的株行中，分別隨機(jī)選擇854-3、854-5材料各2株。以葉片基因組DNA為模版，用hpa1Xoo引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1-A）。將上述PCR產(chǎn)物電泳后，以地高辛標(biāo)記的hpa1Xoo全長(zhǎng)序列為探針，進(jìn)行PCR Southern blot。以水稻白葉枯菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）PXO99菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR的產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照。PCR Southern blot結(jié)果，854-3、854-5陽(yáng)性對(duì)照均在400～500 bp間出現(xiàn)了明顯的陽(yáng)性信號(hào)（圖1-B）。RT-PCR檢測(cè)是以隨機(jī)選擇854-3、854-5 2材料各4株的葉片基因組RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄后，同樣以hpa1Xoo引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2）。分子檢測(cè)所得到的目的條帶單一，測(cè)序結(jié)果為hpa1Xoo，表明引物特異性很高，并且經(jīng)多代選育后轉(zhuǎn)入的外源基因hpa1Xoo仍然能夠在棉花內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在世代間穩(wěn)定遺傳。

3討論

Harpin蛋白在病原菌與植物互作過(guò)程中不僅能賦予轉(zhuǎn)基因植物抗病蟲性，而且能夠激發(fā)一些防衛(wèi)基因的表達(dá)[31，33]。如能夠誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得抗性[34]，能在多種植物上誘導(dǎo)過(guò)敏性細(xì)胞死亡[35]，并能夠啟動(dòng)水楊酸[36]、茉莉酸/乙烯[37]、脫落酸[38]等信號(hào)傳導(dǎo)途徑。不僅編碼Harpin蛋白的基因可以作為外源基因?qū)?，還起到抗病蟲、提高品質(zhì)的作用，而且在植物上的直接施用也能夠賦予植物較好的抗病性[19，39]。多年來(lái)，人們已經(jīng)從多種植物病原細(xì)菌中克隆得到編碼harpin蛋白的hrp基因，并成功將其轉(zhuǎn)入到不同的作物中，使轉(zhuǎn)基因植物獲得了抗性，不同程度上提高了農(nóng)作物的品質(zhì)，例如將編碼harpin蛋白的基因成功轉(zhuǎn)入到煙草[18-21]、馬鈴薯[22]、蘋果[25]、梨[24]、甜菜[18]、小麥[25]、棉花[26]及水稻[15，17，27-29]等植物中，獲得的轉(zhuǎn)基因植物都對(duì)其主要的病原菌產(chǎn)生了較好的復(fù)合抗性。將編碼水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）編碼harpin蛋白的hpa1Xoo基因轉(zhuǎn)入水稻中，使得轉(zhuǎn)基因水稻獲得良好的復(fù)合抗性[15，17，27-29]?？娦l(wèi)國(guó)將hpa1Xoo基因?qū)氲矫藁╖35中，hpa1Xoo基因的表達(dá)可以促進(jìn)防衛(wèi)反應(yīng)，有效降低了棉花黃萎病的發(fā)生，培育篩選過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)hpa1Xoo基因棉花不僅對(duì)黃萎病有抗性，而且對(duì)枯萎病、立枯病也有很好的抗病性，對(duì)棉鈴蟲、棉薊馬、棉大卷葉螟也有較好的抗蟲性[31]，也就是說(shuō)harpin能夠賦予植物多種復(fù)合抗性。本試驗(yàn)中筆者選取了江蘇科騰種業(yè)有限公司提供的棉花材料854，該材料適于長(zhǎng)江中下游種植，將hpa1Xoo基因轉(zhuǎn)入854中，經(jīng)過(guò)2008—2014年獲得了適于長(zhǎng)江中下游種植的棉花材料854-3、854-5，二者兼具高抗黃萎病及良好的農(nóng)藝性狀。

近年來(lái)，研究選育的棉花品種（材料）多為耐黃萎病品種，少部分為抗黃萎病品種，如冀雜1號(hào)黃萎病指數(shù)163[40]，冀棉169黃萎病指數(shù)12.5[41]，遼棉20號(hào)、遼棉25號(hào)、中棉91、遼K133黃萎病指數(shù)分別為16.3、13.0～18.85、248、20.83[42]等，現(xiàn)今仍缺乏高抗黃萎病的品種（材料）。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育棉花抗病品種成為目前最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。不論采用常規(guī)育種還是分子育種技術(shù)培育高抗黃萎病的棉花品種，均存在一定的瓶頸，主要體現(xiàn)在一是缺乏高抗黃萎病的抗源，二是棉花對(duì)黃萎病菌的抗性遺傳特性還存在一些理論和技術(shù)性的問(wèn)題。針對(duì)黃萎病的抗性品種育種，時(shí)常會(huì)發(fā)現(xiàn)某一個(gè)材料或者品系在獨(dú)特年份表現(xiàn)出較好的抗病性，但這種抗性不像對(duì)枯萎病抗性會(huì)具有較好的持久性，在后續(xù)種植過(guò)程中會(huì)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)品種對(duì)黃萎病的抗性又減弱或者丟失，這是困擾抗黃萎病品種選育的一個(gè)較突出的問(wèn)題。目前，我們獲得的854-3、854-5 2個(gè)棉花材料的黃萎病指數(shù)分別為4.23、2.80，在連續(xù)種植的2年中都保持著高抗黃萎病，農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良，有望作為抗黃萎病品種培育過(guò)程中的種質(zhì)或材料。

盡管轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化發(fā)展速度快前景好，能為社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)利益，但不可忽視的是轉(zhuǎn)基因作物確實(shí)存在一系列潛在的安全問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因作物安全性包括兩方面：食品安全性問(wèn)題和環(huán)境安全性問(wèn)題。為能夠安全持久種植利用轉(zhuǎn)基因作物，在轉(zhuǎn)基因作物商品化前要對(duì)其可能帶來(lái)的環(huán)境生物安全問(wèn)題進(jìn)行嚴(yán)格、充分的科學(xué)研究和評(píng)價(jià)，并進(jìn)行有效的生物安全監(jiān)測(cè)和管理[43-48]。我們獲得的轉(zhuǎn)hpa1Xoo基因棉花均規(guī)范種植，設(shè)立了隔離帶，按照相關(guān)規(guī)定對(duì)轉(zhuǎn)基因品種產(chǎn)業(yè)化采取嚴(yán)格謹(jǐn)慎的管理和審批，在盡量消除和降低安全隱患的基礎(chǔ)上科學(xué)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以促進(jìn)整個(gè)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

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