劉青++李朝煒++朱昀等

摘要：以粳糯型常規(guī)旱稻品種“冀旱糯3號”為受體材料，利用農桿菌轉化法將bar基因和lea-1基因轉入旱稻細胞，建立了適用于旱稻的高效轉化體系，最終獲得轉基因植株，并對轉基因植株進行PCR檢測。結果表明：當農桿菌濃度（以D600 nm表示）為0.2時，轉化效果最好。在篩選抗性愈傷時，除草劑的最佳濃度為40 mg/L，對抗性愈傷組織進行預分化能提高其分化率，對轉基因植株進行分子檢測，優(yōu)化后的轉化率提高到37.5%。

關鍵詞：旱稻；除草劑；農桿菌；PCR；lea基因

中圖分類號： Q785；S511.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0042-03

收稿日期：2014-11-05

基金項目：國家轉基因生物新品種培育科技重大專項（編號：2011ZX08001-003）。

作者簡介：劉青（1989—），女，碩士研究生，主要從事生物工程方面的研究工作。E-mail：liuqing12151118@163.com。

通信作者：魏景芳，博士，教授，主要從事植物細胞工程方面的教學與研究工作。E-mail：wjfang@126.com。近年來，全球水資源短缺已成為限制工農業(yè)及人類生活發(fā)展的一大因素，而旱作農業(yè)成為解決水資源短缺問題的關鍵。旱稻在糧食作物中至關重要，需水量少，抗旱性強，與水稻相比具有許多優(yōu)勢，是推行旱作農業(yè)最佳的糧食作物之一[1]。本研究利用農桿菌轉化法將bar基因和lea-1基因轉入冀旱糯3號愈傷組織中，培育出抗旱抗鹽抗除草劑旱稻新品種，解決了旱稻種植時田間雜草和土壤干旱的問題，大大降低了農業(yè)生產成本，從而可以大面積種植旱稻。bar基因是目前抗除草劑基因工程研究中應用最為廣泛的一個基因，也是迄今為止用得最多的一個抗除草劑選擇標記基因，已成功用于小麥[2]、水稻[3]、玉米[4]、油菜[5]等作物中。lea-1基因是目前常用的一種抗旱基因，lea-1基因轉錄翻譯出LEA蛋白的特殊結構可作為脫水保護劑，能部分替代水分子，保持細胞液處于溶解狀態(tài)，穩(wěn)定細胞結構，調節(jié)蛋白和分子伴侶參與植物滲透調節(jié)，在水分脅迫時穩(wěn)定和保護蛋白質的結構及功能，可增強細胞對水的保持能力[6]。俞嘉寧等在2004年在小麥中克隆了1個第三組lea基因Ta-LEA3，研究發(fā)現小麥中該基因的表達與其抗旱性呈正相關[7]。Cheng等將小麥中LEA蛋白PMA1959基因轉化水稻，在干旱脅迫或鹽脅迫復水后，第二代植株的干鮮質量均高于對照組[8]。本試驗將抗草銨膦bar基因作為選擇標記基因，抗旱基因lea-1作為目的基因轉入冀旱糯3號細胞中，建立成熟完善高效的旱稻轉化體系，提高旱稻的轉化率，并對轉基因植株進行PCR檢測。

1材料和方法

1.1旱稻材料

供式材料為粳糯型常規(guī)旱稻品種冀旱糯3號種子。

1.2基因

lea-1基因載體結構如圖1所示。農桿菌菌株Agl-1，轉化載體為pCAMBIA3301，其中含有小立碗蘚胚胎晚期豐富蛋白LEA（Late embryogenesis abundant protein）基因，basta抗性基因，由中國農業(yè)科學院生物技術研究所路鐵鋼老師惠贈。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1細菌培養(yǎng)基YEB：5 g/L牛肉浸膏+1 g/L酵母膏+5 g/L蛋白胨+5 g/L氯化鈉，pH值7.4。AAM：AAM大量+AAM微量+MS有機+鐵鹽+肌醇+0.3 g/L水解酪蛋白+68.5 g/L蔗糖+36 g/L葡萄糖，pH值5.2。

1.3.2愈傷組織誘導培養(yǎng)基/愈傷組織繼代培養(yǎng)基N6大量+B5微量+B5有機+麥芽糖3%+肌醇+水解酪蛋白0.3 g/L+精氨酸0.174 g/L+天冬氨酸0.266 g/L+谷氨酰胺0.876 g/L+2，4-D 2 mg/L+凝膠0.58%，pH值5.8。

1.3.3農桿菌共培養(yǎng)培養(yǎng)基N6大量+B5微量+B5有機+鐵鹽+2，4-D+肌醇+水解酪蛋白0.3 g/L+蔗糖30 g+葡萄糖10 g+AS 20 mg/L，pH值5.2。

1.3.4恢復培養(yǎng)基N6大量+B5微量+B5有機+蔗糖3%+肌醇+鐵鹽+水解酪蛋白0.3 g/L+脯氨酸0.5 g/L+特美汀500 mg/L+凝膠0.58%，pH值6.0。

1.3.5抗性愈傷篩選培養(yǎng)基N6大量+B5微量+B5有機+蔗糖3%+肌醇+鐵鹽+水解酪蛋白0.3 g/L+脯氨酸0.5 g/L+特美汀300 mg/L+草銨膦30 mg/L+凝膠0.58%，pH值6.0。

1.3.6抗性愈傷預分化培養(yǎng)基N6大量+MS微量+B5有機+NAA 1 mg/L+6-BA 3 mg/L+ABA 3 mg/L+蔗糖 3%+鐵鹽+水解酪蛋白0.5 g/L+肌醇+特美汀300 mg/L+草銨膦30 mg/L+凝膠0.58%，pH值6.0。

1.3.7抗性愈傷分化培養(yǎng)基N6大量+B5微量+B5有機+6-BA 1 mg/L+NAA 1 mg/L+肌醇+鐵鹽+水解酪蛋白0.3 g/L+蔗糖3%+植物凝膠，pH值5.8。

1.3.8生根壯苗培養(yǎng)基1/2MS+蔗糖3%+NAA 0.5 mg/L+植物凝膠0.28%，pH值5.8。

1.4旱稻愈傷組織培養(yǎng)

在無菌條件下，用75%乙醇浸泡已脫殼種子2 min，用蒸餾水洗滌3次，30%NaClO浸泡40 min，冀旱糯3號種子較其他旱稻種子相比更易染菌，所以浸泡過程中應不斷搖晃錐形瓶，浸泡后用蒸餾水洗滌3次，重復1次；用無菌濾紙吸干種子表面水分，無菌條件下接種到誘導培養(yǎng)基上，在28 ℃黑暗條件下誘導愈傷組織；培養(yǎng)7 d待少量愈傷長出后，進行切芽，切芽后接種于誘導培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 d后挑選致密、狀態(tài)佳的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)。

1.5農桿菌介導法轉化水稻

1.5.1農桿菌的培養(yǎng)將Agl-1農桿菌菌種（含有l(wèi)ea及bar基因）涂布于固體YEP培養(yǎng)基（含有50 mg/L硫酸卡那霉素和50 mg/L利福平）的培養(yǎng)皿中，28 ℃過夜暗培養(yǎng)3 d，從培養(yǎng)皿上刮取適量長出的農桿菌懸浮于液體AAM培養(yǎng)基中（內含終濃度為60 mg/L的乙酰丁香酮）以備轉化之用。

1.5.2農桿菌轉化為了確定轉化侵染時合適的菌液濃度，需要比較不同濃度菌液對愈傷轉化效率的影響，挑選生長旺盛的愈傷組織，分別放入600 nm處吸光度為0.1、0.2、0.3的AAM菌懸液中浸染，不斷輕輕振搖20 min后，倒掉菌液，將愈傷組織置于無菌濾紙上吸干。用小勺將表面干燥的愈傷均勻撒在鋪有1張無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)3 d后轉移至恢復培養(yǎng)基，恢復培養(yǎng)基中不含篩選劑，主要作用是抑制農桿菌的生長。

1.6篩選

愈傷組織在恢復培養(yǎng)基中生長5 d后轉入篩選培養(yǎng)基中，為了確定轉化篩選時合適的除草劑濃度，需要比較不同濃度除草劑對水稻愈傷生長的影響，將經過轉化的淡黃色、干爽且呈顆粒狀的愈傷組織分別轉入含20、40、60 mg/L草銨膦的培養(yǎng)基中，各培養(yǎng)基中接10板愈傷組織，28 ℃暗培養(yǎng)15 d后，觀察記錄愈傷組織的生長、褐化、死亡情況。

1.7抗性愈傷組織獲得、分化、幼苗生根及移栽

將愈傷組織轉接于篩選培養(yǎng)基篩選2輪，每輪15 d。挑選出淺色抗性愈傷組織接到預分化培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)5～7 d，直到抗性愈傷組織變白。將變白的抗性愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基上，28 ℃下光照培養(yǎng)30 d左右，待其出現綠點；當綠點分化成3 cm左右的芽時，將芽轉接于生根培養(yǎng)基，25 ℃光照培養(yǎng)3周左右，最后將苗移栽至大田。

1.8抗性植株的分子檢測

按Edwards等的方法[9]提取待測的葉片總DNA。引物設計：遵循引物設計原則，利用DNAMAN軟件設計PCR檢測引物，引物序列如下：F：5′-AATTTCTTTCTTTTTGGATTA 3′，R：5′-TGCGGTGTCTTATTTACTAT 3′。PCR反應體系（20 μL）：DNA 2 μL，dNTPMix 1 μL，10×PCR buffer 2 μL，Taq酶0.2 μL，P1 1 μL，P2 1 μL，補水至20 μL。PCR反應程序：96 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.9數據處理

對轉基因植株PCR結果進行分析，統(tǒng)計基因的轉化情況。轉化率各指標的統(tǒng)計參照文獻[10]。綠苗分化率=分化綠苗數/感染愈傷組織數×100%；假陽性率=（綠苗數-PCR陽性植株數）/綠苗數×100%；轉化率=PCR陽性植株株數/感染愈傷組織數×100%。

2結果與分析

2.1愈傷組織的誘導

本研究得出，不含脯氨酸的NB培養(yǎng)基比水稻常用的MS培養(yǎng)基效果更好，將常用碳源蔗糖改為麥芽糖更有利于誘導旱稻愈傷組織。在培養(yǎng)基中添加2 mg/L 2，4-D，能使愈傷生長為最適宜轉化的粟粒大小，接種7 d后進行切芽，否則產生的大量根會影響愈傷組織的生長。20 d后待愈傷長至圖2的狀態(tài)時進行繼代。

2.2農桿菌菌液濃度對轉化的影響

試驗結果表明，600 nm處吸光度為0.1、0.2的菌液侵染后比較容易脫菌，而吸光度為0.3的菌液侵染的愈傷組織脫菌后農桿菌會再次生長（圖3）。但吸光度為0.1的菌液侵染的愈傷組織在后期篩選過程中死亡率較高，菌液濃度過低會降低轉化率。故本試驗采用吸光度為0.2的菌液進行侵染。

2.3篩選劑用量的選擇

將轉化后的愈傷組織恢復5～7 d后在不同篩選濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，統(tǒng)計死亡率，20、40、60 mg/L草銨膦處理死亡率分別為11%、27%、60%。除草劑對愈傷組織的生長有很強的抑制作用，隨著濃度的升高，抑制效果逐漸增強。當濃度為20 mg/L時，愈傷組織死亡率只有11%，褐化現象不明顯（圖4-A）；當濃度為40 mg/L時，愈傷組織明顯褐化，死亡率也大幅提升。所以，為了能有效區(qū)分轉化細胞和非轉化細胞，降低轉基因植株的假陽性率，本試驗除草劑（草銨膦）濃度采用40 mg/L。把轉化后的愈傷組織轉到含40 mg/L除草劑的選擇培養(yǎng)基上，經過15 d篩選，觀察發(fā)現有小部分愈傷組織全部褐化死亡；有些愈傷組織部分褐化，表面松散，雖然沒有徹底死亡，但是沒有長出乳白色的抗性愈傷組織；另有一部分愈傷組織雖然母體褐化，但在生長點長出抗性愈傷組織（圖4-B）。對于最佳篩選劑濃度的確定，要遵循一個原則：既要抑制非轉化細胞生長，又不會對轉化細胞造成太大損害。本試驗采用的除草劑濃度為40 mg/L，低于這個濃度，大部分愈傷組織得不到控制，很難區(qū)分轉化細胞和非轉化細胞，造成大量假陽性；高于這個濃度，則轉化細胞生長也容易被抑制，從而不容易分化。篩選過程為2輪，每輪15 d，由于冀旱糯3號的抗性愈傷組織在篩選過程中生長良好，優(yōu)于其他旱稻品種，無需第3輪篩選。

2.4預分化對分化率的影響

將篩選出的一部分抗性愈傷組織直接接到分化培養(yǎng)基上，分化率為38%，而先經過預分化再轉入分化培養(yǎng)基的分化率為56%，后者較優(yōu)，并且試驗發(fā)現冀旱糯3號的分化率

普遍高于鯤旱1號等其他旱稻品種。

通過觀察發(fā)現，經過預分化的愈傷組織為白色胚狀顆粒，且顏色鮮亮有光澤，在分化培養(yǎng)基上生長較快，長勢較好，未經預分化的愈傷組織顏色發(fā)黃暗淡，生長較慢，容易褐化。分化20 d后觀察，經過預分化的愈傷組織在分化過程中的綠點率高于未經預分化的愈傷組織，并且部分愈傷已分化出苗（圖5）?？梢姡Y選出的抗性愈傷組織在分化之前先經過預分化處理可提高分化率。

由于預分化培養(yǎng)基中含有植物內源激素脫落酸（ABA）[11]，脫落酸是有關生長活性物質代謝的關鍵因子，可具有促進植物吸收營養(yǎng)和協(xié)調體內代謝的能力，故本試驗在預分化培養(yǎng)基中加入ABA可有助于愈傷組織分化。

2.5T0代轉化苗PCR反應結果

提取轉化苗葉片DNA并進行PCR檢測，由圖6可見，3～21號泳道有條帶，并且和作為陽性對照的質粒DNA片段大小一致，說明這20個樣品中含有目的基因，可以確定是陽性植株。將擴增的目的片段進行測序，測序結果與NCBI比對，結果表明出自小立腕蘚的lea-1基因已成功轉化。

2.6數據處理結果

計算得：綠苗分化率41.2%，假陽性率9.1%，轉化率37.5%。

3結論與討論

冀旱糯3號為粳糯型旱稻新品種，其轉化體系與普通旱稻（如鯤旱1號）有一定區(qū)別。本試驗利用農桿菌轉化法將目的基因導入旱稻中，建立了適用于冀旱糯3號的高效轉化體系，確定了最適宜的愈傷誘導培養(yǎng)基為NB+2，4-D（不加脯氨酸），糖源改為麥芽糖，最佳菌液侵染濃度（以D600 nm表示）為0.2，篩選培養(yǎng)基中除草劑最佳濃度為40 mg/L，將篩選出的乳白色抗性愈傷組織經過5d預分化培養(yǎng)，可提高分化

效率。本試驗提取轉基因水稻基因組DNA并進行PCR檢測，結果表明，利用優(yōu)化后的轉化體系可將轉化率提高到375%。本研究結果證明目的基因已成功轉入冀旱糯3號的細胞中，而目的基因的插入位點還需要進一步做tail-PCR研究。

參考文獻：

[1]侯佩臣，王曉冬，王美娟，等. 干旱脅迫下旱稻和水稻對K+和Ca2+的動態(tài)吸收研究[J]. 安徽農學通報，2013，19（23）：5-7，16.

[2]孫重霞，張桂堂，梁榮奇，等. 利用轉基因技術改良小麥品質的研究進展[J]. 分子植物育種，2009，7（2）：398-406.

[3]唐微. 轉Bar基因抗除草劑水稻的培育[J]. 湖北農業(yè)科學，2007，46（4）：488-490.

[4]李國圣，張卿偉，張舉仁，等. 玉米叢生芽體系的建立及抗除草劑轉基因植株再生[J]. 中國科學：C輯：生命科學，2001，31（5）：385-391.

[5]咸拴獅，羅曉麗，王劍. 油菜轉基因進展[J]. 山西農業(yè)科學，2006，34（3）：85-88.

[6]Deane J E，Roversi P，King C，et al. Structures of the shigella flexneri type 3 secretion system protein MxiC reveal conformational variability amongst homologues[J]. Journal of Molecular Biology，2008，377（4）：985-992.

[7]俞嘉寧，張林生，張勁松，等. 小麥耐逆基因-TaLEA3的克隆及在酵母中的功能分析[J]. 生物工程學報，2004，6（6）：832-838.

[8]Cheng Z，Taroglli J，Huang X，et al. Wheat LEA genes PM80 and PMA1959，enhance dehydration tolerance of transgenic rice（Oryza sativa L.）[J]. Molecular Breeding，2002，10：71-82.

[9]Edwards K，Johnstone C，Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis[J]. Nucleic Acids Research，1991，19（6）：1349.

[10]Zhang W，Wu R. Efficient regeneration of transgenic plants from rice protoplasts and correctly regulated expression of the foreign gene in the plants[J]. Theoretical and Applied Genetics，1988，76（6）：835-840.

[11]江玲，萬建民.植物激素ABA和GA調控種子休眠和萌發(fā)的研究進展[J]. 江蘇農業(yè)學報，2007，23（4）：360-365.殷玲，吉挺，李冠華，等. 中華蜜蜂OBP17基因CDS序列及其表達與抗螨性狀的相關性[J]. 江蘇農業(yè)科學，2015，43（11）：45-48.