摘要：通過生物信息學(xué)的方法，利用擬南芥、水稻的MADS-box基因?qū)Σ葺甅ADS-box基因家族進行鑒定和分析，共得到83個草莓MADS-box候選基因，且MADS-box結(jié)構(gòu)域高度保守。進化分析表明，F(xiàn)vMADS1-FvMADS33可被細(xì)分為10個亞組，分別為AG、AGL12、AGL6、AGL2、SE、SVP、FLC、AP3、SOC1、AGL17；FvMADS34-FvMADS83可被細(xì)分為4個亞組，分別為Mα（22個成員）、Mβ（1個成員）、Mγ（17個成員）、Mδ（10個成員）。

關(guān)鍵詞：草莓；MADS-box轉(zhuǎn)錄因子；基因家族；生物信息學(xué)

中圖分類號： S668.403文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0021-05

收稿日期：2014-12-22

基金項目：中國教育學(xué)會學(xué)校文化研究分會“十二五”教育科研課題（編號：0613278A）。

作者簡介：馬明臻（1979—），女，山東壽光人，碩士，副教授，主要從事園藝植物栽培研究。E-mail：1538543122@qq.com。草莓因其漿果營養(yǎng)豐富、鮮紅亮麗、酸甜可口、芳香多汁而深受消費者喜愛，我國是世界草莓第一生產(chǎn)大國，但產(chǎn)量水平仍不足發(fā)達國家的1/2[1-2]。由于草莓存在高雜合性、多倍性等問題，使其常規(guī)育種周期長、工作量大、效率低。近年來，隨著分子生物學(xué)的興起和發(fā)展，草莓生物技術(shù)育種獲得了極大進步。MADS-box基因廣泛參與植物花和果實的發(fā)育、成熟等多個過程。開展草莓MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的研究，有利于探索和解析草莓花、果實在發(fā)育成熟等生理過程中的調(diào)控機制，并能為生物技術(shù)育種提供有價值的信息。

MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的N末端區(qū)域含有一段約為60個氨基酸殘基的保守域，稱為MADS-box保守域，負(fù)責(zé)綁定目的基因中調(diào)控區(qū)域的CArG盒子（CC（A/T）6GG）[3]。MADS-box基因家族成員可根據(jù)進化關(guān)系分為類型Ⅰ（Type Ⅰ）和類型Ⅱ（Type Ⅱ）[4]。類型Ⅱ MADS-box轉(zhuǎn)錄因子不僅含有MADS保守域，還含有Intervening（Ⅰ）區(qū)域、Keratin（K）盒、C-terminal（C）末端3個保守結(jié)構(gòu)域[5]，因此類型Ⅱ又被稱為MIKC類型。相對于Type Ⅱ，Type Ⅰ結(jié)構(gòu)較簡單且缺乏K盒。類型Ⅰ可根據(jù)進化關(guān)系進一步分為4種類型：Ma、Mβ、Mγ、Mδ[7]。近年來，隨著對MADS-box轉(zhuǎn)錄因子研究的不斷深入，現(xiàn)已提出主要調(diào)控花發(fā)育過程的ABCDE模型。ABCDE模型認(rèn)為，A、E類基因調(diào)控萼片的發(fā)育；A、B、E類基因共同調(diào)控花瓣的發(fā)育；B、C、E類基因共同調(diào)控雄蕊的發(fā)育；C、E類基因調(diào)控心皮的發(fā)育；D、E類基因調(diào)控胚珠的發(fā)育[5，8-9]。

本研究以森林草莓（Fragaria vesca）基因組功能數(shù)據(jù)庫[10]為出發(fā)點，利用生物信息學(xué)方法，對草莓MADS-box基因家族成員的數(shù)目、進化關(guān)系、亞組分類進行分析，以期為揭示花和果實發(fā)育過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、加快生物技術(shù)育種等問題提供理論基礎(chǔ)，并為MADS-box基因的進一步克隆提供參考。

1材料與方法

1.1材料

根據(jù)擬南芥中已鑒別的MADS-box基因家族蛋白質(zhì)序列和Pfam數(shù)據(jù)庫的MADS-box保守域（PF00319）序列，利用NCBI提供的BlastP程序（http：//www.rosaceae.org/tools/ncbiblast）檢索草莓基因組功能數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/strawberry/），并下載目的蛋白質(zhì)序列。為進一步確認(rèn)候選MADS-box基因的保守結(jié)構(gòu)域，將候選MADS-box基因逐一提交至NCBI的在線工具Conserved Domain Search（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.sanger.ac.uk/search）進行MADS-box保守區(qū)域確認(rèn)，對含有MADS-box保守域的候選基因進行下一步分析[11]。

1.2方法

利用DNAMAN 6.0序列分析軟件、WebLogo 3在線軟件（http：//weblogo.threeplusone.com/）分析草莓MADS-box基因保守序列。利用MEGA 4.1進化樹分析軟件（http：//www.megasoftware.net）并根據(jù)NJ方法[執(zhí)行參數(shù)：Poission correction、pairwise deletion、bootstrap（1 000次重復(fù)）]，引入擬南芥（AGL）和水稻（OsMADS）的MADS-box蛋白對草莓MADS-box基因進行亞組分類。擬南芥、水稻的MADS-box蛋白序列分別下載于擬南芥（http：//www.arabidopsis.org/）、水稻基因組網(wǎng)站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）[12-13]。

2結(jié)果與分析

2.1草莓MADS-box基因家族的鑒定

通過NCBI提供的BlastP程序搜索草莓基因組功能數(shù)據(jù)庫，共得到83個MADS-box候選基因，其開放閱讀框、編碼氨基酸、分子量、等電點、染色體定位、NCBI預(yù)測基因、與擬南芥同源基因的相關(guān)信息見表1。

2.2草莓MADS-box基因家族保守結(jié)構(gòu)域序列分析

利用DNAMAN 6.0序列分析軟件、WebLogo 3在線軟件對草莓MADS-box基因家族保守結(jié)構(gòu)域進行分析，發(fā)現(xiàn)表1草莓MADS-box基因家族成員信息

FvMADS 基因家族高度保守。經(jīng)WebLogo 3在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，在MADS-box保守結(jié)構(gòu)域，氨基酸23（R）、30（K）位點是保守不變的（圖1）。

2.3草莓MADS-box基因家族進化分析

利用MEGA 4.1進化樹分析軟件對83個FvMADS、62個OsMADS、70個AGL蛋白的MADS-box結(jié)構(gòu)域序列進行進化分析。結(jié)果顯示，215個MADS-box成員被分為Type Ⅰ、Type Ⅱ共2組，其中FvMADS1-FvMADS33屬于Type Ⅱ，F(xiàn)vMADS34-FvMADS83屬于Type Ⅰ。40個OsMADS、39個AGL屬于Type Ⅱ，22個OsMADS、31個AGL屬于Type Ⅰ。對33個FvMADS進一步分析表明，F(xiàn)vMADS1-FvMADS33可被細(xì)分為10個亞組（圖2），分別是AG（FvMADS21、22、24）、AGL12（FvMADS28）、AGL6（FvMADS17）、AGL2（FvMADS4、6、26）、SEP（FvMADS23）、SVP（FvMADS1、2、3、5、12、20）、FLC（FvMADS7、8、11、25、30、31、33）、AP3（FvMADS9、10、15、27）、SOC1（FvMADS13、14、16、18、19）、AGL17（FvMADS29）。對50個FvMADS進一步分析表明，F(xiàn)vMADS34-FvMADS83可被細(xì)分為4個亞組（圖3），分別是Mα（22個成員）、Mβ（1個成員）、Mγ（17個成員）、Mδ（10個成員）。

3結(jié)論與討論

MADS-Box基因家族廣泛存在于高等植物中，參與調(diào)控花的發(fā)育，果實的發(fā)育、成熟、開裂，根的生長發(fā)育、根瘤的形成，頂端分生組織的分化，以及營養(yǎng)代謝、光合作用等許多過程[12]。近年來，隨著植物全基因組測序工作的不斷完成，在基因組層面研究植物的相關(guān)基因家族得以實現(xiàn)。2011年，草莓全基因組測序工作已經(jīng)完成[10]，草莓NAC基因家族、SBP基因家族已通過生物信息學(xué)方法得以鑒定[14-15]。擬南芥[6]、水稻[7]、毛果楊[16]、葡萄[17]、黃瓜[18]、大豆[19]、梅花[20]、大白菜[21]、蘋果[11]的MADS-box基因家族鑒定和進化分析也相繼完成。不同物種MADS-box基因家族成員的數(shù)量存在較大差異，在擬南芥、毛果楊、葡萄、水稻、黃瓜、大豆、梅花、大白菜、蘋果中分別鑒定得到107、105、32、71、43、163、80、160、143個MADS-box基因，各物種MADS-box基因家族成員的分類統(tǒng)計結(jié)果見表2。本研究通過生物信息學(xué)方法系統(tǒng)地鑒定并分析了83個草莓MADS-box候選基因，其中MIKCC、MIKC*類型分別為32、1個；Mα、Mβ、Mγ、Mδ分別為22、1、17、10個（表2）。盡管擬南芥、毛果楊、葡萄、水稻、黃瓜、大豆、梅花、大白菜、蘋果MADS-box基因家族的鑒定已經(jīng)完成，但關(guān)于其功能驗證的研究仍較少。MIKCC類型MADS-box基因的大多數(shù)功能已被驗證，下一步研究的重點應(yīng)傾向于研究較少的類型Ⅰ MADS-box基因。

通過草莓基因組數(shù)據(jù)庫可以更好、更快、更全面地了解草莓MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的序列和結(jié)構(gòu)，從而對其進行功能鑒

定和分析，以期驗證草莓MADS-box基因家族在花、果實生長發(fā)育等過程中的調(diào)控作用?？寺『头蛛x草莓MADS-box基因并進行轉(zhuǎn)基因功能驗證，探索其在營養(yǎng)生長、生殖生長中的調(diào)控作用，將成為進一步研究的重點。

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