李鳳元

（遼寧省重大動(dòng)物疫病應(yīng)急中心110161）

炭疽桿菌基因檢測方法研究進(jìn)展

李鳳元

（遼寧省重大動(dòng)物疫病應(yīng)急中心110161）

近年來，動(dòng)物炭疽病在我國北方地區(qū)夏季汛期時(shí)有發(fā)生。動(dòng)物發(fā)生炭疽疫情時(shí)，要對(duì)疑似炭疽動(dòng)物盡快進(jìn)行確診。另外，在疫情防控期間不可避免地對(duì)周圍環(huán)境造成一定程度的污染，而最有可能污染土壤和水源。炭疽桿菌進(jìn)入土壤就會(huì)形成芽孢，芽孢對(duì)惡劣環(huán)境具有極強(qiáng)的抵抗能力，可存活數(shù)十年。而進(jìn)入水源后，極易污染水流流經(jīng)的其他地區(qū)，使其成為新的潛在炭疽疫源地。當(dāng)炭疽芽孢被攝入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的菌血癥，進(jìn)而會(huì)不同程度的引發(fā)炭疽疫情。因此，及時(shí)有效的診斷，以及在使用有效消毒藥物對(duì)周圍環(huán)境進(jìn)行消毒后對(duì)疫區(qū)土壤、水源的污染狀況進(jìn)行調(diào)查是十分必要的。本文介紹了針對(duì)炭疽桿菌基因檢測方法的研究進(jìn)展，為該病的診斷、環(huán)境污染監(jiān)測、疫情防控提供技術(shù)依據(jù)。

炭疽桿菌；檢測方法；研究進(jìn)展；綜述

炭疽是由炭疽桿菌 （Bacillus Anthrax）感染引起的一種人獸共患病。由于炭疽芽孢和細(xì)菌本身的性質(zhì)，直接以其為靶標(biāo)的檢測技術(shù)在特異性、靈敏度等方面已難以獲得突破性的進(jìn)展。雖然應(yīng)用比較復(fù)雜的儀器設(shè)備可能解決部分問題，但由此帶來的復(fù)雜度及費(fèi)用增加又難以避免[1]。在炭疽檢測上，由于基因技術(shù)的發(fā)展使得針對(duì)基因檢測方法已達(dá)到較為理想的效果，靈敏、高效是此類技術(shù)最大的優(yōu)勢，基因檢測技術(shù)已經(jīng)逐漸取代基于芽孢和細(xì)菌繁殖體的檢測方法?，F(xiàn)將炭疽桿菌基因檢測技術(shù)的研究進(jìn)展分別進(jìn)行介紹。適合于針對(duì)環(huán)境中炭疽病原體以及感染動(dòng)物的檢測。

1 基因檢測技術(shù)

1.1 PCR技術(shù)和探針技術(shù)

很多學(xué)者采用PCR技術(shù)對(duì)炭疽桿菌或芽孢進(jìn)行檢測，只要靶位合適，引物設(shè)計(jì)合理，就會(huì)獲得良好的檢測效果。榮光華等建立的實(shí)時(shí)定量PCR檢測靈敏度可達(dá)到每個(gè)反應(yīng)10～100個(gè)拷貝，利用12種相關(guān)菌株評(píng)價(jià)后獲得100%特異性，對(duì)10份模擬污染標(biāo)本和20份對(duì)照標(biāo)本檢測，所有污染標(biāo)本均被檢出，所有對(duì)照標(biāo)本均為陰性[2]。曲識(shí)、史清海等采用TaqMan熒光探針技術(shù)，針對(duì)炭疽芽孢桿菌pXO1、pXO2質(zhì)粒上的基因設(shè)計(jì)引物，建立了一種簡便、快速、定量檢測炭疽芽孢桿菌的PCR方法，可特異且靈敏地檢測土壤標(biāo)本中可疑目標(biāo)菌，檢測靈敏度可達(dá) 2.5×103cfu/早土壤[3，4]。 譚維國等分別針對(duì)炭疽桿菌capA基因和PA基因設(shè)計(jì)引物以及熒光雙標(biāo)記探針，通過優(yōu)化探針、引物濃度、反應(yīng)體系試劑組分等參數(shù)，建立了可同時(shí)檢測capA基因和PA基因的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其檢測靈敏度分別可達(dá)到每個(gè)反應(yīng)5和50拷貝，且具有良好的特異性[5]。趙婷婷等建立了一種簡便的新型交叉引物恒溫核酸擴(kuò)增結(jié)合層析試紙條方法，可以快速可視化檢測炭疽芽胞桿菌核酸。該方法是通過序列比對(duì)挑選出炭疽芽胞桿菌質(zhì)粒上的特異性基因pXO2，設(shè)計(jì)引物、探針并合成標(biāo)記，建立核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，用金標(biāo)免疫層析試紙條快速檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。用建立的檢測方法檢測炭疽Sterne疫苗株的靈敏度為6×103cfu/ml，且與枯草芽胞桿菌、矮小芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌等相似菌株無交叉反應(yīng)，具有良好的敏感性和特異性[6]。

1.2 LAMP技術(shù)

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院李亭潞等人曾針對(duì)荔枝炭疽病菌的GS基因序列設(shè)計(jì)了LAMP特異性引物，通過條件優(yōu)化建立了檢測荔枝炭疽病菌的LAMP體系，通過檢測結(jié)果表明，LAMP引物特異性較好，能準(zhǔn)確地從樣品中檢測出炭疽菌， 檢測靈敏度為 100f早/μl， 分別高于常規(guī)PCR檢測方法的100倍和10000倍[7]。 Ben Hatano等將LAMP技術(shù)應(yīng)用于炭疽桿菌的檢測，在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi) （25ul）能夠檢測大約1000個(gè)拷貝。雖然存在污染的可能性，但其極高的敏感性和特異性顯示了該項(xiàng)技術(shù)在檢測炭疽桿菌上的潛力[8]。

1.3 芯片技術(shù)

文海燕等針對(duì)炭疽芽孢桿菌、布魯菌、類鼻疽伯克霍爾德菌等5種生物恐怖細(xì)菌的特異性基因序列設(shè)計(jì)了6對(duì)引物和相應(yīng)特異性探針，經(jīng)多重PCR擴(kuò)增并用生物素標(biāo)記相應(yīng)的基因片段，標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與包被在不同編碼微球上的相應(yīng)探針雜交，用懸浮芯片掃描儀檢測其監(jiān)測體系特異性好、靈敏度高，可以將炭疽芽孢桿菌作為檢測目標(biāo)之一[9]。王靜等建立了基于雙抗體夾心免疫學(xué)檢測的編碼微球懸浮芯片方法，對(duì)炭疽桿菌芽孢檢測最低檢出限為4.2×103cfu/ml，動(dòng)態(tài)范圍為103～107cfu/ml，該方法具有很好的敏感性和特異性[10]。

2 小結(jié)及展望

基于基因檢測技術(shù)在檢測炭疽桿菌上具有簡便、快捷、靈敏度高和特異性好等特點(diǎn)，在炭疽桿菌檢測方法的研究中，作為臨床診斷、環(huán)境污染監(jiān)測、疫情防控等方面快速檢出炭疽桿菌的重要手段，基于基因的檢測技術(shù)將會(huì)進(jìn)一步受到重視和得到發(fā)展。

[1]劉炬,徐俊杰,陳薇,等.炭疽桿菌檢測方法的研究現(xiàn)狀與展望 [J].微生物學(xué)報(bào),2012,52(7):810-815.

[2]榮光華,夏懿,朱詩應(yīng),等.炭疽芽胞桿菌染色體特異序列的篩選及實(shí)時(shí)定量檢測[J].微生物學(xué)報(bào),2006,46(6):900-905.

[3]曲識(shí),史清海,何寧.定量PCR快速檢測炭疽芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)研究[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2010,34(3):275-279.

[4]史清海.土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢桿菌定量PCR檢測技術(shù)的研究[D].史清海,2010.

[5]譚維國,陳文琦,呂恒,等.炭疽桿菌雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立[J].東南國防醫(yī)藥,2013,15(6):556-559.

[6]趙婷婷,孫文錚,楊宇,等.CPA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測炭疽芽胞桿菌方法的建立 [J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2014,37(4):247-250.

[7]李亭潞,司徒俊鍵,江立群,等.荔枝霜疫霉和荔枝炭疽菌LAMP檢測技術(shù)的建立[J].中國菌物學(xué)會(huì)2015年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集,2015.

[8]HatanoB,MakiT,ObaraT,et al.LAMP Using a Disposable Pocket Warmer for Anthrax Detection,a Highly Mobile and Reliable Method for Anti-Bioterrorism[J].Japanese Journalof Infectious Diseases,2010,63:36-40.

[9]文海燕,王靜,劉衡川,等.五種生物恐怖細(xì)菌基因懸浮芯片多重檢測方法的建立[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,40(2):325-329.

[10]王靜,楊赟韻,喬舜,等.懸浮芯片法與生物素-親和素ELISA法檢測炭疽桿菌芽孢比較研究[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2009,32(6):436-440.