白純 董紅錳 李先亮 賀強

·綜述·

調節(jié)性T細胞過繼回輸在移植免疫耐受誘導中的臨床應用研究

白純 董紅錳 李先亮 賀強

調節(jié)性細胞在器官移植的排斥反應和自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。調節(jié)性T細胞的過繼回輸治療，能夠維持免疫細胞的平衡，提供供體特異的免疫調節(jié)作用，達到很好的臨床治療效果。實體器官移植的調節(jié)性細胞治療，在動物研究中，已經(jīng)得到很好的驗證，臨床應用前景巨大。但是在臨床的試驗中，還有很多亟待解決的問題。新的理論突破，比如免疫互噬理論和免疫嵌合等理論能夠給臨床調節(jié)性細胞的應用帶來新思路。

肝移植； T淋巴細胞, 調節(jié)性； 組織療法； 免疫耐受

近幾年對于免疫機制的研究提示，可以利用調節(jié)性細胞機理誘導移植物免疫耐受并長期存活，這種自然免疫調節(jié)機制稱為調節(jié)性細胞介導的免疫耐受。調節(jié)性細胞介導的免疫耐受可以在不使用免疫抑制劑情況下誘導移植物長期的存活。目前了解到的調節(jié)性細胞有調節(jié)性T細胞、調節(jié)性B細胞和調節(jié)性DC細胞等[1]，在T細胞中又分為CD8+和CD4+的調節(jié)性細胞[2]，而其中研究最多的是CD4+的T細胞，其表達的CD25和FOXP3作為區(qū)分標志，這群細胞稱做CD4+調節(jié)性T細胞[3]。目前的研究表明這類細胞的失衡和功能的改變，直接影響臨床疾病的發(fā)生發(fā)展和轉歸，并且可能在某些領域疾病的治療中起到重要作用。

早期的研究結果提示調節(jié)性T細胞在臨床疾病中有如下主要作用，一方面在正常體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)中可以抑制過度的免疫反應，從而減少自身免疫疾病發(fā)生。文獻報道內(nèi)分泌失調性腸病-X染色體連鎖綜合征，是由于調節(jié)性T細胞的FOXP3基因沉默所引起的[4-5]；在早產(chǎn)兒的壞死性小腸炎的發(fā)病機制主要是由于FOXP3轉錄基因的沉默造成CD4/ CD8效應細胞的比例失衡破壞免疫系統(tǒng)[6]；在自發(fā)性免疫性肝炎的研究中，耗竭調節(jié)性T細胞使肝臟的炎癥加重，正常情況下CD4+調節(jié)性T細胞可以介導自免肝的免疫耐受，延緩肝臟損傷的同時防止其它感染性損傷的發(fā)生[7]。如上所述在動物、人體體內(nèi)調節(jié)性T細胞的缺乏都會造成自身免疫疾病。另一方面調節(jié)性T細胞可以緩解移植物抗宿主病。在造血干細胞移植同時回輸調節(jié)性T細胞可以很好減小移植后患者的近期和遠期排斥幾率，并減少化療藥所造成的腫瘤再發(fā)等問題[8]。如上所述，這些成果促進調節(jié)性T細胞在實體器官領域臨床的研究和應用的開展。

一、調節(jié)性T細胞治療移植領域中的應用

調節(jié)性T細胞作為一種治療手段在幾十年前出現(xiàn)[9]，但現(xiàn)在面臨的挑戰(zhàn)還很嚴峻。Lee等[10]通過小鼠骨髓移

植模型證明了過繼回輸調節(jié)性T細胞可以有效的防止移植物抗宿主病的發(fā)生或延緩病程的進展，而用單一的抑制性細胞因子治療不能達到相同的效果[11]。Richards等[12]結合熒光免疫顯像技術發(fā)現(xiàn)調節(jié)性T細胞由胸腺產(chǎn)生，然后遷移到外周，如組織、皮膚、粘膜等處，在遷移過程中其數(shù)量會與局部炎癥反應相關，局部炎癥反應輕時其數(shù)量會很低。Liu等[13]在移植皮膚后使用重組人IL-10給予治療可以介導局部皮膚免疫排斥反應的延遲發(fā)生，其發(fā)生機制可能與CD4+CD25+的T細胞有關。為了確定CD25+的T細胞能否用于細胞治療，Hara等[14]團隊在CBA小鼠體內(nèi)移植入B10小鼠的心臟，然后再移植供體同系的皮膚到接受心臟移植的CBA小鼠，僅回輸效應性細胞，看到了移植皮膚的急性排斥反應，而同時回輸CD4+CD25+T細胞的一組，有80﹪的個體沒有出現(xiàn)移植皮膚的急性排斥反應。可見調節(jié)性T細胞在移植物免疫耐受中起到了重要的作用。

2011年Di Ianni等[15]進行半相合造血干細胞移植病例的對照研究。參與實驗的28例白血病患者，回輸半相合供者提供的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞。在后續(xù)的研究中實驗組患者未給予任何預防移植物抗宿主疾病的預防措施。在12個月的中位隨訪時間中，與對照組相比該組患者的移植物抗宿主病表現(xiàn)比較緩和。此外與前期的臨床數(shù)據(jù)相比，在移植后免疫力可以及時恢復，尤其是T細胞介導的免疫反應的恢復減少了各種機會性感染。

Brunstein等[16]使用了體外擴增并激活的臍帶血產(chǎn)生的調節(jié)性T細胞進行了血液惡性腫瘤的臨床治療試驗。對照組給予麥考酚嗎乙酯和環(huán)孢素，實驗組給予麥考酚嗎乙酯和西羅莫司[17-18]化療方案加調節(jié)性T細胞。在大約12個月的隨訪中，接受調節(jié)性T細胞回輸治療的患者中表現(xiàn)出近似無白血病的生存狀態(tài)，與歷史對照組相比觀察期內(nèi)疾病復燃率幾乎為零。從以上臨床試驗來看，調節(jié)性T細胞的回輸對于治療慢性移植物抗宿主病具有良好的效果，但其遠期效果還需要進一步的隨訪來證明。

以上的臨床實驗都是針對血液疾病進行的外周血中的調節(jié)性T細胞實驗，而對于實體器官移植后回輸調節(jié)性T細胞在移植器官局部的免疫反應情況目前還不是很明確。

1989年Hall等[19]發(fā)表的一個研究中提到了調節(jié)性細胞在實體器官移植物中的分布，研究者給予PVG到DV大鼠心臟移植模型應用兩周環(huán)孢素，誘導出了大鼠長期的移植心免疫耐受，模型表現(xiàn)出了一種對于供體移植物非特異性的免疫耐受，對于第三方皮膚移植物其排斥作用依然很劇烈，但對于供者來源的移植皮膚表現(xiàn)出了長期的免疫耐受，并在移植物中發(fā)現(xiàn)了“W3/25+”的T細胞，這些細胞分布在幼稚的淋巴組織中。而且Hall還發(fā)現(xiàn)這種非特異性的免疫抑制狀態(tài)和環(huán)孢素沒有關系。Shimon等[20]提出了這群CD4+的調節(jié)性T細胞以CD25+作為標記。K?ksoy等[21]團隊在心臟移植模型中發(fā)現(xiàn)，在耐受動物外周血和脾臟中CD4+CD25+T細胞的含量要比排斥組的高并且血液中IL-10含量明顯升高，而IL-10是一種起負性調節(jié)的細胞因子。

國內(nèi)學者在誘導排斥的肝移植模型大鼠中發(fā)現(xiàn)，在肝移植排斥過程中CD8+調節(jié)性T細胞在局部組織中占的比例要比CD4+調節(jié)性T 細胞高，很有可能其誘導免疫耐受的能力要比CD4+調節(jié)性T細胞強[22]。這些實體器官移植基礎的研究成果給調節(jié)性T細胞在臨床上的應用提供了很好的證據(jù)。

二、第一個實體器官移植的臨床試驗：The one study

如何在實體器官移植中，發(fā)揮出調節(jié)性細胞治療的作用，誘導免疫耐受，是一個非常具有挑戰(zhàn)的課題。2011年李先亮[23]在法國南特提出，通過調節(jié)性細胞過繼回輸，重塑受體免疫調節(jié)機制，誘導免疫耐受的理念，并在大鼠的心臟移植模型中進行了驗證。通過放射清髓后，過繼回輸免疫耐受性的CD8+調節(jié)性細胞可以誘導心臟移植受體免疫耐受。本研究也發(fā)現(xiàn)在移植免疫耐受的大鼠體內(nèi)，移植物和脾臟是主要的調節(jié)性細胞聚集地，骨髓在脾切除后可以代替脾臟的作用，成為調節(jié)性細胞產(chǎn)生和聚集的地方[23]。這些研究成果為臨床應用開展奠定一些基礎。其它研究中心也發(fā)現(xiàn)調節(jié)性細胞過繼回輸在動物模型中，取得了巨大的成功，但是如何走向臨床，還需要更多的研究和驗證。

調節(jié)性T細胞治療面向臨床時會涉及到如下問題，一方面是用于治療細胞的純化和擴增方法，另一方面是治療的有效性和安全性的評估[24]。多克隆的純化和擴增調節(jié)性細胞在動物實驗和臨床上都可以實現(xiàn)[25-26]，而在治療過程中的有效性和安全性尚缺合適的評估標準。為了更好的評估調節(jié)性細胞在實體器官移植領域的應用的有效性和安全性，實現(xiàn)細胞治療的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，以法國南特器官移植中心和德國Rosenberg移植中心牽頭，在歐洲開展器官移植領域第一個調節(jié)性細胞的臨床試驗研究：The One Study[27]。

該項目是基于基礎和臨床的多中心的聯(lián)合研究，旨在找出合適的用于實體器官移植的調節(jié)性細胞，以及可靠的評估標準用于移植后調節(jié)細胞治療有效性和安全性評估，以便于形成統(tǒng)一的臨床治療方案。該研究的一個報道使用異基因B細胞庫來擴增同種特異性的自然調節(jié)性T細胞[28]，作為調節(jié)性細胞的擴增辦法。雖然該項目有其它不同的用于治療的調節(jié)性細胞的報道，但是在有效性和安全性方面沒有形成共識。該研究的最終臨床結果，可能會帶來突破性的進展，但是從目前的進展來說，還是謹慎的樂觀。因為開展調節(jié)性細胞治療的工作，還有許多問題需要解答。

三、調節(jié)性細胞臨床上應用面臨的問題

（一）調節(jié)性細胞和免疫抑制劑的關系

調節(jié)性細胞治療的出現(xiàn)以及在造血干細胞領域的應用，使其在實體器官移植領域看到了希望。目前的臨床實驗結果表明調節(jié)性T細胞與傳統(tǒng)的免疫抑制藥相比有明顯的優(yōu)勢。短期臨床隨訪結果比單用免疫抑制劑要好，Brunstein

等[16]在造血干細胞移植領域的調節(jié)性T細胞治療研究顯示出了良好的結果，評估調節(jié)性細胞治療的安全性問題還得進行Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期臨床實驗。

目前臨床上主要采用免疫抑制藥和生物制劑（主要是單克隆抗體）來達到器官移植患者免疫抑制的目的。免疫抑制藥的使用會使外周血的白細胞和淋巴細胞不同程度下降，部分藥物會導致調節(jié)性T細胞下降，但也有部分藥不會影響調節(jié)性細胞，這也許是體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)平衡重調的一個良好契機[29]。

在具體免疫抑制藥對于調節(jié)性T細胞的研究方面，調節(jié)性T細胞回輸治療的藥物代謝學研究提示他克莫司會影響到調節(jié)性T細胞特別是CD25+FOXP3+細胞的FOXP3表型的表達，使過繼回輸?shù)恼{節(jié)性細胞半衰期縮短，但不影響CD25+表型的表達。雷帕霉素可以增加回輸調節(jié)性T細胞的半衰期，CD25+FOXP3+表型可以穩(wěn)定存在，在回輸后60 d仍然可以檢測到標記的過繼回輸調節(jié)性T細胞。在調節(jié)性細胞過繼回輸治療時合理的使用免疫抑制藥可以最大程度的保證調節(jié)細胞的治療量效果，減少由于急、慢性排斥反應造成的不良反應和對于過繼回輸?shù)恼{節(jié)性T細胞的過度抑制[30]，其它的免疫抑制對于調節(jié)性T細胞的影響有待進一步研究。在動物實驗方面，Rifai等[34]觀察到過繼傳輸調節(jié)性細胞，如果數(shù)量足夠，一次回輸，不需要免疫抑制劑，就可以順利誘導免疫耐受。但是在臨床上，還缺少有效的觀察結果和評估有效性的手段，考慮到臨床器官排斥的危險后果，聯(lián)合不影響調節(jié)性細胞的免疫抑制劑，然后逐漸減量，調節(jié)性細胞分次回輸，逐漸增加劑量，可能是合理的選擇。

單克隆抗體針對細胞表面受體的阻滯是特異的，可以特異性的阻滯參與排斥反應有關的目的細胞，但其介導的免疫耐受是非供體特異性的，會產(chǎn)生其他副作用。雖然目前采用的調節(jié)性細胞都是多克隆的調節(jié)性細胞[23]，相應產(chǎn)生的免疫抑制是廣泛但具有供體特異性的，對于器官移植或者是干細胞移植方面，由于移植物是細胞或組織級別的，其產(chǎn)生的免疫排斥反應是受體免疫系統(tǒng)暴露在一系列抗原環(huán)境下產(chǎn)生的。所以應用供體特異性的多克隆調節(jié)性T細胞回輸是可以實現(xiàn)免疫抑制的，相對免疫抑制劑而言，調節(jié)性細胞用于器官移植免疫耐受的治療，免疫系統(tǒng)的各類細胞數(shù)是不會減少的，在不減少的情況下調節(jié)性T細胞比例是增高的。這對于造血干細胞移植和器官移植來說可以降低患者機會性感染和免疫抑制劑造成再發(fā)腫瘤的風險[15-16]。

（二）對于調節(jié)性T細胞治療有效性的檢測方法評估

研究者發(fā)現(xiàn)，T細胞在激活后數(shù)小時內(nèi)表面標志物會持續(xù)表達[31]，如CD25、CD69、CD154，如上的發(fā)現(xiàn)都是基于流式細胞術對激活的調節(jié)性細胞介導的免疫抑制和激活的調節(jié)性細胞分析得出的結論。研究者發(fā)現(xiàn)在新鮮的標本中CD4+CD25+調節(jié)性細胞和CD4+CD25hiCD127low調節(jié)性細胞，在7 h有CD69、CD154在抑制性細胞表面分子表達，在96 h可在上清中分離。這些抑制分子表達的同時有IL-2和IFN-γ的參與，提示與調節(jié)性細胞誘導免疫耐受有關。在調節(jié)性細胞誘導免疫耐受的治療時，如上的發(fā)現(xiàn)給評估治療有效性提供了可能使用的檢測方法，但需要更多的實驗來驗證。應用細胞標記技術可以觀測到調節(jié)性T細胞在體內(nèi)調節(jié)性細胞庫中的比例及半衰期，可作為檢測調節(jié)性細胞有效性的一個補充，同時需要繼續(xù)研究其他敏感的檢測方法。調節(jié)性細胞治療的有效性還需要通過抗移植物抗體、移植物功能、移植物局部病理等化驗檢查全面評估。動物實驗結果表明，過繼回輸?shù)恼{節(jié)性細胞，會長期存在受體體內(nèi)，可能誘導受體產(chǎn)生免疫耐受性的調節(jié)性細胞[32]。

（三）調節(jié)性細胞治療的種類和機制

CD4+CD25+的調節(jié)性T細胞是目前臨床Ⅰ期實驗較多的調節(jié)性細胞，其實現(xiàn)免疫抑制的方式主要分兩類，一類是非細胞接觸方式，另一類是細胞接觸方式[33]。非細胞接觸抑制方式主要是通過分泌抑制性的細胞因子實現(xiàn)對效應T、B細胞的抑制，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞可以分泌IL-4、IL-10、IL-35、TGF-β來實現(xiàn)其非接觸抑制目的，但是在體內(nèi)有很多細胞可以產(chǎn)生這樣的細胞因子，而文獻報道單使用細胞因子無法誘導免疫耐受[11]。除了釋放抑制性細胞因子外，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞還可以釋放溶解細胞的物質顆粒酶A、顆粒酶B，配合補體破壞排斥反應的效應性T細胞，達到免疫抑制作用。CD4+CD25+調節(jié)性T細胞還可以通過細胞接觸方式來實現(xiàn)其免疫抑制的功能，在抗原提呈細胞通過MHCⅡ分子提呈抗原肽到效應體細胞時供者特異性的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞通過接觸影響抗原提呈細胞的抗原提呈過程，阻止效應性T細胞激活擴增，同時可能會誘導免疫耐受性DC產(chǎn)生，但是缺乏臨床試驗的有利驗證。

除了上述已經(jīng)進入臨床試驗的CD4+調節(jié)性細胞外，也有其它調節(jié)性細胞介導免疫耐受的報道。有文獻報道和其他中心研究發(fā)現(xiàn)在動物實驗中可以觀察到CD8+調節(jié)性細胞介導免疫耐受的現(xiàn)象[34]，而且在臨床上一些長期存活的患者和自發(fā)性免疫耐受的患者外周血中，都觀察到CD8+調節(jié)性細胞的存在和數(shù)量上的增加，其功能類似于CD4+CD25+T細胞[35]。通過腺病毒轉錄CD40 Ig移植物內(nèi)注射，阻斷CD40-CD40L信號通路，建立大鼠的心臟移植免疫耐受模型，該免疫耐受由CD8+調節(jié)性細胞介導，并可以過繼傳輸給下一代受體。發(fā)現(xiàn)CD8調節(jié)性細胞的供體特異性的免疫抑制功能主要通過非成熟的pDCs介導，CD8調節(jié)性細胞是通過IFN-γ和IDO依賴的兩種機制通過接觸和非接觸兩種方式作用于CD4效應細胞實現(xiàn)其增殖和活化，來達到控制局部和系統(tǒng)的免疫反應，誘導免疫耐受[35]。臨床的免疫耐受到底是由一種調節(jié)性細胞介導還是一個調節(jié)性細胞網(wǎng)絡共同起作用，還需要更多的臨床觀察，根據(jù)如上發(fā)現(xiàn)推斷不同的移植器官、不同的治療誘導方案，會有不同的調節(jié)性細胞起到作用，因此除了CD4+調節(jié)性細胞外，CD8+調節(jié)性細

胞，調節(jié)性樹突細胞都是應該關注的重要研究對象[36]。

（四）供體特異性的調節(jié)性細胞的鑒別和產(chǎn)生

調節(jié)性細胞有兩種起源，一種是胸腺中自然產(chǎn)生的稱做自然調節(jié)性T細胞，另一種是在局部適應性免疫反應環(huán)境中產(chǎn)生的稱為誘導調節(jié)性T細胞[37]。前期研究發(fā)現(xiàn)，過繼回輸自然調節(jié)性T細胞并不能誘導免疫耐受預防急性排斥反應發(fā)生，仍然會導致移植物的失功能[14]。只有過繼回輸誘導后的免疫耐受性調節(jié)性細胞，才有可能導致免疫耐受的產(chǎn)生。

在動物實驗方面前期實驗針對CD8調節(jié)性細胞進行了系統(tǒng)的研究。發(fā)現(xiàn)在大鼠心臟移植模型中，CD8調節(jié)性細胞介導了免疫耐受的過繼傳輸，MHCⅡ陽性表達是判定供體特異性CD8+調節(jié)性T細胞的表面標志。極少量正?；罨腡細胞也可以高表達MHCⅡ抗原，一般比例在1﹪左右，甚至更低。但在大鼠心臟移植模型中，介導免疫耐受的CD8+調節(jié)性T細胞群中，有50﹪的CD8+調節(jié)性T細胞高表達MHCⅡ抗原，過繼傳輸CD8+MHCⅡ+調節(jié)性T細胞可以誘導供體特異性的免疫耐受，而不是CD8+MHCⅡ-調節(jié)性T細胞，證明了MHCⅡ+是供體特異性調節(jié)性細胞的表面標記[38]。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，免疫耐受個體內(nèi)存在互噬作用的細胞，而且其互噬作用是發(fā)生在CD8調節(jié)性細胞和漿細胞源性樹突細胞之間[39]。這類CD8調節(jié)性細胞高表達MHCⅡ抗原，過繼傳輸MHCⅡ+的CD8調節(jié)性細胞，可以在下一代受體產(chǎn)生免疫耐受。體外細胞培養(yǎng)實驗，也證實了CD8調節(jié)性細胞和pDCs之間可以發(fā)生互噬作用，產(chǎn)生具有新的功能CD8調節(jié)性細胞和pDCs。因此李先亮課題組提出了通過免疫細胞互噬作用，能夠誘導免疫嵌合的調節(jié)性細胞，這也是免疫嵌合理論的進一步發(fā)展和深入[39]。目前正在體外誘導擴增這類發(fā)生互噬作用的CD8調節(jié)性細胞和pDCs，并過繼傳輸給移植受體，期待能夠在移植受體誘導免疫耐受。因此互噬作用也可能是未來臨床誘導免疫耐受的新途徑。

根據(jù)國內(nèi)外基礎實驗和臨床實驗的結果以及本中心的發(fā)現(xiàn)，調節(jié)性細胞，尤其是CD4+和CD8+的調節(jié)性細胞在造血干細胞移植和實體器官移植方面有很重要的研究價值和臨床應用前景。調節(jié)性細胞在移植術后患者體內(nèi)介導免疫耐受，消除了傳統(tǒng)免疫抑制劑對受體的副作用，如再發(fā)腫瘤、機會性感染以及繼發(fā)的一系列心腦血管疾病及內(nèi)分泌代謝疾病[40-42]，克服了單克隆抗體高度特異性的阻滯體內(nèi)所有受體而帶來不必要的對于表達受體的細胞的系統(tǒng)性阻滯[43-44]。調節(jié)性細胞介導的免疫耐受更溫和、更特異、更符合臨床需求。目前的實驗數(shù)據(jù)表明調節(jié)性細胞治療臨床應用潛力很大，需要更加精心設計的臨床實驗來評估它的安全性以及制定相應的評估有效性標準。免疫互噬作用和免疫嵌合的調節(jié)性細胞等理論和實驗研究，能夠解決調節(jié)性細胞供體特異性和檢測標志物的問題，為臨床調節(jié)性細胞治療帶來更多的可行性。

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Clinical application of regulatory T cells infusion to induce transplant immune tolerance

BaiChun, Dong Hongmeng, Li Xianliang, He Qiang. Department of hepato-biliary-pancreatic surgery, Bei Jing Chao-Yang Hospital, the Capital Medical University, Bei Jing 100020, China

Regulatory cells play a critical role in onorgan transplantation and autoimmune disease. The regulatory T cells infusion therapy can maintain the balance of immune status, lead to specific immune regulation, and is effective in clinical settings. Animal experiments have demonstrated that the regulatory cells therapy could induce immune tolerance in solid organ transplantation. However, there are several questions to be answered and the clinical use of regulatory cell therapy is still limited. The breakthrough of new theories opens the possibility of clinical use of regulatory T cells, such as trogocytosis and chimeric tolerogenic regulatory cells.

Liver transplantation； T-Lymphocytes, regulatory； Tissue therapy；Immune tolerance

2016-05-23）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.05.008

國家自然基金面上項目（81571554，81273270，81041110，81471590）

100020 北京，首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院肝膽胰腺外科

李先亮，Email：lixianliangbjcy@126.com

白純,董紅錳,李先亮,等. 調節(jié)性T細胞過繼回輸在移植免疫耐受誘導中的臨床應用研究[J/CD].中華細胞與干細胞雜志:電子版, 2016, 6(5):307-311.